Aurora-A激酶在急性髓系白血?。ˋML）中的表達(dá)及其抑制劑VX-680靶向治療AML的機(jī)理研究.pdf

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是源于造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病，含有大量異質(zhì)性(heterogeneous)細(xì)胞亞群是其典型特征之一。 采用全反式維甲酸(ATRA)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)，開創(chuàng)了靶向治療白血病的先河并取得了革命性的成功。95％以上的APL患者都具有t(15；17)染色體易位而形成PML/RARα融合基

2、因，ATRA靶向降解PML-RARα融合蛋白，恢復(fù)野生型RARα和PML基因功能，解除融合蛋白對基因轉(zhuǎn)錄的抑制，消除其對細(xì)胞分化的阻遏及對凋亡的抑制，進(jìn)而治療APL。ATRA極大地提高了APL的完全緩解率(CR)，ATRA+CT(化學(xué)治療)可使APL達(dá)到了分子遺傳學(xué)上的治愈。近年來與AML發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的其他基因突變也被發(fā)現(xiàn)，包括Flt3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication，ITD)，F(xiàn)lt3酪氨酸激酶

3、域突變(tyrosine kinase domain，TKD)，c-Kit以及Ras等，這些突變往往異常激活信號傳導(dǎo)而使白血病細(xì)胞獲得增殖優(yōu)勢和凋亡逃逸能力。近年來，一種新的參與細(xì)胞有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族——Aurora激酶家族，包括Aurora-A，-B和-C被逐漸認(rèn)識，該激酶家族在調(diào)控染色體準(zhǔn)確分離從而維持染色體穩(wěn)定性的機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用。Aurora-C在精子中高表達(dá)，其功能可能與精子發(fā)生有關(guān)。Aurora-B與另3個

4、染色體過客蛋白(chromosome passenger protein)——內(nèi)著絲粒蛋白(INCENP)、Survivin和Borealin結(jié)合形成復(fù)合物，此復(fù)合物有調(diào)節(jié)動原粒(centromere)的功能，是糾正染色體排列和分離、調(diào)整紡錘體檢查點(check point)功能和胞質(zhì)分裂所必需的。Aurora-A激酶作為參與細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵因子，其主要功能包括調(diào)節(jié)G2/M轉(zhuǎn)變，中心體分離、成熟，紡錘體裝配和穩(wěn)定以及胞質(zhì)分裂，這些都提

5、示了Aurora-A激酶在調(diào)節(jié)染色體穩(wěn)定性方面扮演著重要的角色。而Aurora-A之所以倍受關(guān)注是因為它與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在NIH3T3細(xì)胞中異源表達(dá)Aurora-A可以導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化(transformation)以及染色體數(shù)目異常；用活化型Aurora-A轉(zhuǎn)化Rat1細(xì)胞后可以使裸鼠致瘤，它是一種潛在的癌基因。事實上，已在血液系統(tǒng)惡性疾病如非何杰金淋巴瘤(NHL)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)及多種惡性實體腫瘤，包括結(jié)腸癌、乳腺

6、癌、卵巢癌等中發(fā)現(xiàn)有Aurora-A的高表達(dá)，并且這種高表達(dá)同腫瘤組織細(xì)胞的非整倍體相關(guān)，同時往往伴隨著預(yù)后較差的臨床病理分期、較差的臨床療效及更低的遠(yuǎn)期生存率等，均提示預(yù)后不良。但VX-680潛在的抗白血病機(jī)制及其與AML中Aurora激酶表達(dá)的關(guān)系目前仍不清楚。為此，本研究作了如下探討： 1、Aurora-A激酶在AML中的表達(dá)收集了98例原發(fā)初治的AML患者及12名健康志愿者的骨髓標(biāo)本，分離及培養(yǎng)骨髓原代細(xì)胞，同時選擇了2

7、株AML細(xì)胞系，利用Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測了Aurora-A激酶蛋白在AML骨髓原代細(xì)胞及AML細(xì)胞株中的表達(dá)情況。 本實驗旨在通過觀察Aurora-A激酶蛋白在AML細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其與AML患者臨床各指標(biāo)間的關(guān)系，為其作為AML治療的新靶點提供理論依據(jù)。 2、VX-680抑制AML細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的研究我們嘗試將Aurora-A激酶小分子抑制劑VX-680作用于AML，原代細(xì)胞

8、、正常骨髓原代細(xì)胞以及AML細(xì)胞株。本實驗擬嘗試將Aurora-A激酶小分子抑制劑VX-680作用于AML細(xì)胞，觀察其對AML細(xì)胞牛長增殖及誘導(dǎo)凋亡的影響，以明確該小分子抑制劑靶向治療AML的作用。 3、VX-680靶向Aurora-A激酶高表達(dá)AML細(xì)胞亞群的特異性研究利用統(tǒng)計學(xué)方法深入分析了AML患者及正常骨髓細(xì)胞對Aurora-A激酶小分子抑制荊VX-680誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用反應(yīng)不一的原因。利用Western blot法檢

9、測了其他激酶如Aurora-B激酶和FLT3在AML及正常骨髓原代細(xì)胞中的表達(dá)，同時還利用PCR法檢測了FLT3基因突變的情況。結(jié)合這些因素深入分析了VX-680靶向作用AML細(xì)胞的特異性靶點。 本實驗旨在尋找VX-680靶向作用AML細(xì)胞時最特異的細(xì)胞亞群，為其將來應(yīng)用于臨床治療提供可參考的適用指征。 4、WX-680誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制在結(jié)合細(xì)胞周期同步化方法的基礎(chǔ)上利用流式細(xì)胞術(shù)分析了VX-680對AML細(xì)

10、胞的細(xì)胞周期的影響；利用免疫細(xì)胞熒光雙染色法觀察了VX-680對AML細(xì)胞紡錘體形成的影響；利用Western blot法檢測了VX-680作用與AML細(xì)胞后線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；擬用RNA干擾的方法降低AML原代細(xì)胞及HL-60細(xì)胞中Aurora-A激酶的表達(dá)，觀察siRNA作用后細(xì)胞周期、紡錘體形成、凋亡通路信號蛋白的改變，并與VX-680的作用后的效應(yīng)相比較。 本實驗通過觀察VX-680對AML細(xì)胞的細(xì)胞周期以

11、及凋亡信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響，以明確VX-680誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 5、VX-680與VP16聯(lián)合誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡的作用研究將VX-680與VP16聯(lián)合作用于AML及正常骨髓原代細(xì)胞，利用AnnexinV-FITC/PI雙染色法以及流式細(xì)胞術(shù)觀察藥物作用后的細(xì)胞凋亡情況；采用不同的給藥順序，評價順序給藥(sequential therapy)與聯(lián)合用藥(combined therapy)間對細(xì)胞

12、凋亡作用的不同影響。 本實驗擬通過研究VX-680與VP16聯(lián)合誘導(dǎo)AML骨髓原代細(xì)胞凋亡的藥物效應(yīng)，明確VX-680與AML傳統(tǒng)化療藥物間的聯(lián)合作用，評價其治療AML的臨床應(yīng)用潛力。 本課題研究的結(jié)果及意義總結(jié)如下： 1、首次明確了Aurora-A激酶蛋白在原發(fā)初治AML患者骨髓原代細(xì)胞及AML細(xì)胞株中的異常高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在原發(fā)初治AML骨髓中該激酶蛋白的高表達(dá)往往伴有外周血高白細(xì)胞計數(shù)。不僅揭示了Aurora

13、-A激酶作為一種新的白血病標(biāo)志物可能與AML的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)，也為其作為分子靶向治療的新靶點提供了理論依據(jù)。 2、明確了Aurora-A激酶小分子抑制劑VX-680能夠劑量及時間依賴性的抑制AML細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示出了其對白血病細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用；更重要的是，VX-680能夠特異性的靶向誘導(dǎo)Aurora-A高表達(dá)的AML原代細(xì)胞亞群發(fā)生凋亡，而對Aurora-A低表達(dá)的AML細(xì)胞群或正常骨髓細(xì)胞活性影響較

14、?。河^察到VX-680與傳統(tǒng)化療藥物VP16聯(lián)合誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡具有協(xié)同效應(yīng)。因此，VX-680作為新的分子靶向藥物以其特異性高，效果顯著，毒性低而顯示出了其在治療AML中的光明前景。 3、闡明了VX-680誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，包括：G2/M期阻滯、紡錘體單極化、Akt活性下調(diào)、PARP剪切、Caspase通路的激活以及上調(diào)促凋亡因子Bax，同時下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而介導(dǎo)線粒體途徑的凋亡等多種機(jī)制。