白花丹莖葉水提物祛痰及抗氣道炎癥活性的研究.pdf

1、目的:
　　為開(kāi)發(fā)新的祛痰及抗氣道炎癥有效藥物，通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察白花丹地上部分莖葉水提物（APPZ)的毒性反應(yīng)；氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)，考察APPZ是否具有祛痰作用；建立小鼠急性肺損傷模型，觀察APPZ對(duì)于急性氣道炎癥的干預(yù)作用，并進(jìn)一步觀察霧化吸入給藥方式對(duì)于小鼠急性氣道炎癥的治療效果。
　　方法:
　　1、APPZ的急性毒性實(shí)驗(yàn)：（1）APPZ的制備：白花丹地上部分新鮮莖葉置60°C干燥箱48h后，剪碎、稱(chēng)重后放入燒

2、杯，加20倍量的純凈水，煮沸后文火煎煮1 h，冷卻、收集過(guò)濾液；濾渣再加入20倍量純凈水，重復(fù)煎煮2次；3次濾液混合后，文火濃縮濃度至0.1 g/ml；冷卻至室溫后分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩＃?）20只SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體重18g-22g，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)第1天，對(duì)照組給予生理鹽水30ml/kg，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予小鼠，上、下午各一次，每次0.6 ml。給藥后連續(xù)觀察14天，記錄小鼠活動(dòng)情況及死亡數(shù)量。
　　2、酚紅排泄實(shí)

3、驗(yàn)：60只SPF級(jí)雄性C57LB/6小鼠，體重18g-22g，隨機(jī)分為6組；正常對(duì)照組每天灌胃30ml/kg生理鹽水（NS），氯化銨組每天灌胃氯化銨1g/kg，藥物組分高、中、低、極低劑量組分別灌胃給予小鼠APPZ，約合白花丹干重質(zhì)量3.0 g/kg、1.5 g/kg、0.75 g/kg、0.375 g/kg。連續(xù)給藥5天后，每只小鼠腹腔注射1.5％酚紅溶液，0.2 ml/10g；半小時(shí)后收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，通過(guò)分光光

4、度計(jì)在波長(zhǎng)546 nm處比色，計(jì)算酚紅排泄量。
　　3、（1）通過(guò)經(jīng)口-氣管?chē)婌F給藥脂多糖（LPS）的方法，建立小鼠急性肺損傷模型，觀察造模后第3天和第5天小鼠BALF中總蛋白濃度。（2）APPZ對(duì)小鼠急性氣道炎癥的干預(yù)作用：90只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體重20g-22g，隨機(jī)均分為6組，除正常組經(jīng)口-氣管?chē)婌F150ul/只NS，其余組給藥LPS建立急性肺損傷模型。待動(dòng)物清醒后，正常對(duì)照組和模型組灌胃給予NS（30ml/k

5、g），模型+藥物高劑量、模型+中劑量、模型+低劑量組灌胃給予APPZ分別相當(dāng)于3.0 g/kg、1.5g/kg、0.75g/kg；模型+地塞米松組小鼠灌胃給予地塞米松（DXM）1 mg/kg。連續(xù)給藥5天后，BCA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠BALF中總蛋白濃度，ELISA法檢測(cè)炎癥因子包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量；比較肺臟濕/干重比值（W/D）；肺組織HE染色觀察比較各組間小鼠肺部病理變化。
　　4、APP

6、Z霧化吸入治療小鼠急性氣道炎癥的效果：100只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體重20g-22g，隨機(jī)分均為5組。建立急性肺損傷模型后（同研究方法3），正常對(duì)照組和模型組每天8ml生理鹽水霧化；模型+白花丹高劑量組每天給予16 ml（0.1g/ml）的藥物霧化吸入（分上、下午兩次進(jìn)行）；模型+白花丹低劑量組每天給予一次8 ml（0.1g/ml）霧化吸入治療；模型+地塞米松組每天給予地塞米松1 mg/kg灌胃；每組動(dòng)物分別于給藥第3天和第5

7、天各處死一半，檢測(cè)內(nèi)容同研究方法3。
　　結(jié)果:
　　1、KM小鼠灌胃給藥6 g/kg，持續(xù)觀察14天，小鼠沒(méi)有出現(xiàn)死亡及其他急性毒性反應(yīng)，說(shuō)明該APPZ水提物毒性較低。
　　2、小鼠支氣管肺泡灌洗液酚紅濃度比較顯示，與空白對(duì)照組（8.25±0.64ug/ml）比較， APPZ高劑量組（13.20?3.07ug/ml），中劑量組（12.74?1.44ug/ml）和低劑量組（10.67?2.28ug/ml）的小鼠氣管酚紅

8、排泄量顯著增加（P<0.05）。氯化銨組，APPZ高、中、低劑量組的小鼠氣管酚紅排泄量改善率分別為62.9%，60%，54.4%，29.3%。
　　3、（1）小鼠經(jīng)口-氣管?chē)婌F給予LPS的方式可成功建立小鼠急性肺損傷模型，通過(guò)比較確定，LPS劑量在2mg/ml，150ul/只時(shí)，作為本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制的劑量；（2）APPZ灌胃對(duì)小鼠急性氣道炎癥的干預(yù)作用：各組收集到的BALF中總蛋白濃度，同模型組（427.68±80.84ug/ml）

9、對(duì)比， APPZ高劑量組（329.35±14.23ug/ml），正常組（270.17±62.37ug/ml）和地塞米松組（263.69±77.44ug/ml）同模型組比較，差異具有顯著性（P<0.05）；各組小鼠BALF中TNF-a，IL-6含量同模型組相比有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺的濕干比值，正常對(duì)照組（4.68±0.26），地塞米松組（4.33±0.05）和APPZ高劑量組（4.87±0.07）同模型組（5.41±0.67）比

10、較有顯著性差異（P<0.05）；顯微鏡下觀察模型組小鼠肺泡腔及其周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，其余各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肺泡腔清晰可見(jiàn)，周?chē)鷥H有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　4、APPZ霧化吸入治療急性氣道炎癥的效果顯示：（1）APPZ霧化給藥3天后，與模型組BALF中總蛋白濃度（793.95±186.19μg/ml）相比，地塞米松組（556.36±139.69μg/ml）、低劑量霧化組（628.5

11、9±140.47μg/ml）及正常組（308.65±45.82μg/ml）與模型組相比，差異具有顯著性（P<0.05）；與模型組比較，TNF-a、IL-6的濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，肺組織濕干比值的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）APPZ霧化給藥5天后小鼠BALF中總蛋白濃度，與模型組（552.99±217.47μg/ml）相比地塞米松組（382.69±63.80μg/ml）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-a的濃度，同模型組（

12、841.20±217.47μg/ml）對(duì)比，高劑量霧化組（256.31±122.88pg/ml），地塞米松組（174.80±104.85pg/ml），低劑量霧化組（478.83±147.36pg/ml）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但是IL-6的濃度和肺組織的濕干比值各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡下肺組織的病理變化可見(jiàn)：模型組小鼠肺泡腔及其周?chē)写罅恳灾行粤＜?xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，其余各組

13、小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，周?chē)胁糠盅装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，其中霧化給藥5天的小鼠同霧化給藥3天的小鼠肺組織病理觀察比較，肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少，肺泡腔清晰可見(jiàn)。
　　結(jié)論:
　　APPZ給予小鼠灌胃后，無(wú)明顯急性毒性反應(yīng)，說(shuō)明其毒性較低；氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物高劑量組與祛痰劑--氯化銨的作用結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明APPZ有顯著的祛痰作用；觀察APPZ灌胃及霧化吸入對(duì)小鼠急性氣道炎癥干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩種給藥方式對(duì)急性氣道炎