生長分化因子-5誘導(dǎo)人黃韌帶細胞成骨分化的作用及機制.pdf

1、黃韌帶骨化（Ossification of ligamentum flavum，OLF）是一種發(fā)生在脊柱韌帶的特殊類型異位骨化形式。OLF主要累及亞洲黃種人，尤其是日本人。男女發(fā)病率文獻報道不一，約為2-4：1，隨年齡增長而發(fā)病率增高，年齡大于65歲的亞洲人群發(fā)病率高達20%。OLF可發(fā)生在頸，胸和腰椎，但好發(fā)生于下胸椎和胸腰段，導(dǎo)致椎管狹窄，常引起脊髓壓迫受損，表現(xiàn)出一系列的神經(jīng)功能障礙。目前，OLF的臨床治療局限于椎管減壓手術(shù)，但是

2、其診斷延誤、OLF的多發(fā)性和術(shù)后骨化復(fù)發(fā)是造成患者脊髓功能恢復(fù)差的重要原因。近年來，OLF逐漸引起國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注與重視。國內(nèi)、外文獻有關(guān)OLF病因?qū)W研究的報道逐漸增加，雖然目前認為遺傳因素、生長因子、力學(xué)因素、內(nèi)分泌與代謝異常等因素與OLF發(fā)病密切相關(guān)。但其具體發(fā)病機制仍不清楚。 組織學(xué)研究證實骨化黃韌帶組織表現(xiàn)為韌帶肥厚，彈力纖維減少，膠原纖維大量增生、腫脹，在骨化與非骨化韌帶組織間的交界區(qū)（骨化移行區(qū)）可見大量的軟骨樣細

3、胞。因此，這提示OLF屬于異位軟骨內(nèi)成骨病變。免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)某些成骨誘導(dǎo)因子（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPRs）在骨化移行區(qū)的未成熟的軟骨樣細胞中陽性表達。體內(nèi)、外實驗進一步證實BMP-2誘導(dǎo)OLF形成的作用。提示這些成骨誘導(dǎo)因子可通過旁分泌或自分泌的形式與黃韌帶細胞胞膜上的受體結(jié)合并刺激細胞成骨分化，在黃韌帶的軟骨內(nèi)骨化過程發(fā)揮重要作用。前期研究表明體外分離培養(yǎng)的下胸椎黃

4、韌帶骨化患者非骨化區(qū)域的黃韌帶細胞呈現(xiàn)典型的成骨細胞表型特征。近年來，體外研究表明牽張應(yīng)力和瘦素等致病因素可誘導(dǎo)人黃韌帶細胞向成骨細胞分化。因此，各種致病因素誘導(dǎo)黃韌帶細胞向成骨細胞分化可能是OLF發(fā)病的細胞學(xué)基礎(chǔ)。 有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員由多種同功酶組成，其中ERK1/2，p38和JNK發(fā)現(xiàn)較早，生物學(xué)功能研究較為透徹。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細胞外信號引起細胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可被多種刺激因素激活，通過三

5、級酶促級聯(lián)反應(yīng)，最終磷酸化靶蛋白，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達，參與細胞的增殖、分化及凋亡等多種生理過程。許多研究證實MAPK信號通路參與成骨細胞增殖分化過程。最近，體外研究表明牽張應(yīng)力和瘦素通過激活MAPK信號通路誘導(dǎo)黃韌帶細胞向成骨細胞分化。因此，MAPK信號通路在OLF的發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。 生長分化因子-5 （GDF-5）又稱為BMP-14或軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白-1（CDMP-1），是TGF-β超家族中的新成

6、員。其編碼基因定位于20q11.2染色體，由兩個外顯子（exon）和一內(nèi)含子（intron）組成，全長488 kb，其編碼多肽共含有501個氨基酸，由位于N端的信號肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽構(gòu)成。翻譯后的前體蛋白裂解得到成熟肽，由其發(fā)揮生物活性作用。成熟的GDF-5二聚體分子量為25KD，而單體分子為13.6KD。不同種屬來源的GDF-5分子具有高度同源性。它與骨軟骨發(fā)育，肌腱/韌帶損傷修復(fù)、神經(jīng)營養(yǎng)等密切相關(guān)。 GDF-

7、5像其它TGF-β超家族的成員（如BMPs）一樣，以同源二聚體的形式與跨膜Ser-Thr激酶受體結(jié)合，通過胞漿內(nèi)Smad信號途徑和非Smad信號途徑（如MAPK）將其信號傳導(dǎo)到核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達。最近，MAPK信號通路在GDF-5生物效應(yīng)中的作用引起一些學(xué)者的重視。體外研究證實GDF-5可誘導(dǎo)人臍靜脈平滑肌細胞的ERK磷酸化和小鼠軟骨細胞系A(chǔ)TDC5的p38和ERK磷酸化。 體內(nèi)研究表明人重組GDF-5 （rhGDF-5）

8、可促進骨缺損修復(fù)和脊柱后外側(cè)融合；將含rhGDF-5的基質(zhì)植入大鼠皮下或肌肉內(nèi)，可誘導(dǎo)異位骨形成。體外研究報道GDF-5能誘導(dǎo)多能間充質(zhì)細胞C2C12、脂肪干細胞、骨髓基質(zhì)細胞和骨膜細胞等多種細胞向成骨細胞分化。因此，GDF-5可誘導(dǎo)多種細胞向成骨細胞分化和異位骨形成。 組織病理學(xué)研究表明GDF-5在OLF的黃韌帶組織中呈陽性表達，而在無骨化的對照樣本中無表達。這一研究結(jié)果提示GDF-5可能是OLF的主要致病因子之一，但其具體機

9、制不清楚。因此，研究GDF-5在OLF發(fā)病過程中分子機制，以其作為切入點進一步闡明OLF的發(fā)病機制，將為臨床OLF的預(yù)防、早期干預(yù)與治療提供新思路。 目的： 1.探討人黃韌帶細胞的分離與體外培養(yǎng)方法，建立黃韌帶細胞系。 2.探討rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細胞成骨分化的作用。 3.探討rhGDF-5對人黃韌帶細胞的MAPK信號通路激活的作用，并觀察信號阻斷劑對rhGDF-5誘導(dǎo)黃韌帶細胞成骨分化的影響。

10、 方法： 1.人黃韌帶細胞的分離與培養(yǎng)。 采集胸腰椎骨折患者后路減壓術(shù)中和腰椎間盤突出癥患者后路開窗髓核摘除術(shù)中的黃韌帶標(biāo)本。黃韌帶標(biāo)本用PBS液清洗后，剪成大小約0.5 mm的碎塊，并用0.2%Ⅰ型膠原酶消化液消化90 min。將膠原酶預(yù)消化組織塊均勻貼附在6孔細胞培養(yǎng)板或10 ml培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中靜置8h后，沿孔板側(cè)壁小心加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

11、培養(yǎng)5-7d后首次更換培養(yǎng)液，隨后每隔3天更換。原代細胞從組織塊遷出、生長至80%融合時，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的細胞消化液消化并傳代培養(yǎng)。 倒置相差顯微鏡下觀察細胞從組織塊遷出時間，原代和傳代細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法分析傳1、3、5代細胞（P1、3、5）的增殖特性，繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間，并比較細胞傳5代以內(nèi)的生物學(xué)特性的變化。對傳3代細胞進行波形蛋白和Ⅰ型膠原

12、的免疫熒光化學(xué)染色。 2.rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細胞成骨分化的作用。 （1）黃韌帶細胞堿性磷酸酶（ALP）活性檢測。 人黃韌帶細胞與100ng/ml thGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14 d或分別與0，10，50，100，500ng/ml thGDF-5共孵育10 d后，收集細胞，提取細胞總蛋白，檢測ALP活性。 （2）黃韌帶細胞骨鈣素mRNA表達的檢測。 人黃韌帶細胞與100ng/

13、ml rhGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14 d或分別與0，10，50，100，500ng/ml rhGDF-5共孵育10 d后，收集細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測黃韌帶細胞的骨鈣素mRNA表達，以β-acin為內(nèi)對照，分析骨鈣素mRNA相對表達的變化。 （3）黃韌帶細胞骨鈣素蛋白表達的檢測。 人黃韌帶細胞與100ng/ml rhGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14d或分別

14、與0，10，50，100，500ng/ml rhGDF-5共孵育10d后，收集細胞，提取細胞總蛋白，免疫印跡法（Western blot）檢測黃韌帶細胞的骨鈣素蛋白表達，以β-acin為內(nèi)對照，分析骨鈣素蛋白相對表達的變化。 （4）黃韌帶細胞骨鈣素定位表達的檢測。 人黃韌帶細胞接種于置有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入含10.0%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞生長達80%融合后，加入100ng/ml rhGDF-5繼續(xù)培

15、養(yǎng)10d。免疫熒光化學(xué)染色檢測骨鈣素的定位表達，細胞爬片依次用1：100稀釋的山羊抗骨鈣素多克隆抗體和1：50稀釋的FITC熒光標(biāo)記的兔抗山羊IgG孵育，共聚焦顯微鏡下觀察。 （5）茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。 人黃韌帶細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入含10.0%FBS的DMEM培養(yǎng)。細胞達融合后，加入100ng/ml rhGDF-5或者對照培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)28d。茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成。 3.rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌

16、帶細胞成骨分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 （1）MAPKs磷酸化活性的檢測。 人黃韌帶細胞與100 ng/ml rhGDF-5分別共孵育0、5、15、30、60、120、240min后收集細胞；在阻斷實驗中，黃韌帶細胞與20μM的信號阻斷劑U0126、SB203580或SP600125預(yù)孵育60min，將含阻斷劑的培養(yǎng)基吸出，無血清培養(yǎng)基清洗一次。再加入含100ng/ml rhGDF-5的培養(yǎng)基，60分鐘后收集細胞，提取細胞總蛋白

17、。Western blot檢測MAPK（ERK1/2、p38、JNK）總蛋白及磷酸化蛋白含量，以總蛋白為對照，分析磷酸化蛋白含量相對值的變化。 （2）MAPKs信號阻斷劑對rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細胞成骨分化的影響。 人黃韌帶細胞與20μM U0126、SB203580或SP600125和100 ng/ml rhGDF-5共孵育10d后收集細胞，提取細胞總蛋白，檢測ALP活性，Western blot檢測骨鈣素蛋白表達