甲狀腺激素T3對心外膜祖細(xì)胞增殖的作用及其機制.pdf

1、背景：缺血性心臟病是目前威脅人類健康的主要疾病，其發(fā)病率高、致死率高已成為重大健康問題。干細(xì)胞治療逐漸成為一種對心肌再生和修復(fù)很有前景的治療方法，已有多種類型的干細(xì)胞被證明具有向心肌分化的能力。心外膜祖細(xì)胞（Epicardial progenitor cells，EPCs）是一種包含多種祖細(xì)胞標(biāo)記基因的祖細(xì)胞池，其可分化形成起搏細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種心系細(xì)胞，它們是與功能性心臟細(xì)胞最接近的心臟祖細(xì)胞，是目前心臟再生研究的

2、熱點。但由于EPCs細(xì)胞本身數(shù)量有限，將其應(yīng)用于損傷修復(fù)治療時需要其原位細(xì)胞數(shù)量的擴增，若體外細(xì)胞移植也面臨需要體外擴增的問題，所以尋找能促進EPCs增殖的方法有重要意義。
　　甲狀腺和心臟是兩個關(guān)系密切的臟器，甲狀腺激素對心臟的發(fā)育及生理功能有重要作用。甲狀腺激素通過主要通過基因組及非基因組機制發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近期報道顯示三碘甲狀腺氨酸（Triiodothyronine， T3）能通過非基因組效應(yīng)促進新生小鼠心肌細(xì)胞的爆發(fā)性增殖

3、，以及人成骨樣細(xì)胞及胰島β細(xì)胞的增殖。而T3是否會促進EPCs細(xì)胞的增殖，尚無研究報道。
　　目的：明確T3是否會促進EPCs的增殖，并探討其可能存在的潛在機制。
　　方法：培養(yǎng)C57BL/6小鼠E12.5天胎齡的心外膜祖細(xì)胞，分別用不同濃度T3（5、10、20、40、80、160 nmol/L）干預(yù)EPCs細(xì)胞24、48及72小時，用CCK-8（cell counting kit-8，CCK-8）測定其增殖水平。為了明確T

4、3是否通過基因組途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，將培養(yǎng)EPCs細(xì)胞隨機分為4組：對照組， T3（10nmol/L），T3（10nmol/L）+甲狀腺素核受體抑制雙酚A（bisphenol A， BPA，100μmol/L）及BPA組（100μmol/L）干預(yù)72小時后用免疫熒光測定 Ki67的表達(dá)及 CCK-8測定其增殖水平。為進一步明確 T3是否通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases， MAPK

5、s)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的非基因組途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，同樣將培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞隨機分為：對照組，T3（10 nmol/L）， T3（10 nmol/L）+MAPK/ERK特異抑制劑U0126（10μmol/L），及U0126組（10μmol/L）。利用CCK-8、細(xì)胞免疫熒光染色、流式細(xì)胞技術(shù)及定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real

6、time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：所培養(yǎng)出的細(xì)胞呈“鋪路石”樣，形態(tài)單一且高表達(dá)EPCs細(xì)胞標(biāo)記Tbx18（T-box transcription factor18）及WT1（Wilms tumor protein1）mRNA，而幾乎不表達(dá)肌鈣蛋白cTnT（cardiac troponin T），免疫熒光染色提示Tbx18及WT1陽性細(xì)胞數(shù)量高。 CCK-8測

7、定顯示T3能明顯促進心外膜祖細(xì)胞的增殖，且呈濃度及時間依賴性。當(dāng) T3濃度為10 nmol/L，干預(yù)72h時便能明顯地觀察到EPCs增殖的現(xiàn)象，所以后續(xù)實驗中T3的濃度選擇為10 nmol/L，干預(yù)時間為72h。甲狀腺素核受體抑制劑 BPA不能抑制這一過程。進一步研究顯示 T3組（10 nmol/L）EPCs細(xì)胞MAPK1、MAPK3及Ki67 mRNA的表達(dá)較對照組分別增加了2.9、3及4.1倍（p<0.05）。同時，T3組細(xì)胞周期蛋