內皮祖細胞(EPCs)對移植性動脈硬化的作用及其機制研究.pdf

1、在過去的40年中,雖然器官移植術后急性排斥反應(acute rejection,AR)得到了有效的控制,但移植性動脈硬化(transplantarteriosclerosis,TA)卻嚴重制約著移植受者的長期生存。移植性動脈硬化的病理改變特點為移植物內各級動脈內膜發(fā)生彌漫性、向心性增厚,引起管腔狹窄。早期病變主要表現為血管壁炎癥細胞的浸潤,晚期則主要以內膜增厚,管腔狹窄為主。目前認為,移植性動脈硬化是免疫因素和多種非免疫因素共同造成的血

2、管內膜反復損傷、修復的結果。但是,迄今為止,其確切的發(fā)病機制仍不清楚,因此,缺乏有效的預防和治療措施。
　　 內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)作為一類具有多種分化潛能、自我增殖等干細胞性質的特殊細胞,在參與組織損傷、修復及血管形成中發(fā)揮重要作用,并與多種心血管疾病的發(fā)病密切相關。最近研究表明:EPCs參與移植性動脈硬化發(fā)病過程。雖然,移植性動脈硬化的確切發(fā)病機制尚未闡明,但是,近幾

3、年在EPCs研究領域所取得的諸多成果為探究移植性動脈硬化的發(fā)病機制提供了新的思路和依據。大量研究顯示,移植性動脈硬化患者外周血EPCs數量明顯減少,而且受體源性EPCs可以歸巢至移植物血管內膜損傷部位,分化為內皮細胞和/或血管平滑肌細胞并參與移植性動脈硬化內膜增生。但是,受體源性EPCs在移植性動脈硬化發(fā)病中的具體作用,尚有爭議;EPCs歸巢至移植物血管內膜增殖、分化為內皮細胞具體機制,仍有待于做進一步研究。因此,探討EPCs在移植性動

4、脈硬化的具體作用及相關機制,不僅可望為揭示移植性動脈硬化的發(fā)病機理提供重要線索,進而為治療提供了新的方法。
　　 本研究首先通過同種異品系小鼠腹主動脈移植建立移植性動脈硬化模型,并用流式細胞儀檢測其外周血EPCs數量變化,探討EPCs數量動態(tài)變化與移植性動脈硬化病變之間的關系。繼之,將體外培養(yǎng)擴增的骨髓源性EPCs輸入移植性動脈硬化模型體內,觀察增加EPCs數量對移植性動脈硬化的影響,探討受體源性EPCs在移植性動脈硬化中的作用

5、。由于VEGFR-2可在EPCs表面表達并發(fā)揮重要作用,因此,在第三部分通過酪氨酸激酶抑制劑Vandetanib特異性阻斷VEGFR-2,觀察在體外條件下對骨髓單個核細胞向EPCs分化及對后者的生物學功能影響。最后,在小鼠腹主動脈移植術后用Vandetanib進行干預,觀察Vandetanib影響EPCs數量及生物學功能情況,從而判斷其對移植動脈硬化可能具有的抑制作用。
　　 第一部分小鼠移植性動脈硬化模型的建立及外周血EPCs

6、數量動態(tài)變化
　　 目的:建立小鼠移植性動脈硬化模型,觀察移植性動脈硬化病變過程中外周血EPCs數量的動態(tài)變化及意義。
　　 方法:以C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,建立同種異品系腹主動脈移植模型。光鏡和電鏡觀察移植動脈的病理改變,并采用計算機圖像分析系統(tǒng)分析術后2周、4周及6周移植血管內膜增生情況。流式細胞儀檢測術前及術后1、3、7、14及28天外周血EPCs數量變化。
　　 結果:術后3天,

7、移植動脈內膜損傷并伴有明顯的炎癥細胞浸潤。術后2周,觀察到移植動脈內膜增厚,術后4周、6周內膜增生逐漸加重,移植動脈管腔明顯狹窄。外周血EPCs數量術后早期增多,3天達到高峰,此后迅速減少,術后2周、4周顯著低于術前水平。
　　 結論:同種異品系小鼠(C57BL/6→BALB/c)腹主動脈移植成功復制出移植性動脈硬化的病變特點,可用于移植性動脈硬化發(fā)病機理和防治措施的研究。外周血EPCs數量的動態(tài)變化與移植性動脈硬化病變密切相關

8、,可成為預測移植物動脈硬化發(fā)病的新指標。
　　 第二部分 輸入受體骨髓源性EPCs對移植性動脈硬化的促進作用
　　 目的:探討輸入體外培養(yǎng)擴增的受體骨髓源性EPCs對移植性動脈硬化的影響。
　　 方法:密度梯度離心法分離小鼠骨髓源性單個核細胞,并以貼壁培養(yǎng)法誘導培養(yǎng)EPCs。采用C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,通過同種異品系腹主動脈移植建立小鼠移植性動脈硬化模型。EPCs移植組移植術后通過尾靜脈

9、輸入EPCs,對照組則注入相應體積的生理鹽水。同時將CM-DiI標記的:EPCs移植給受體小鼠,進行EPCs移植后體內示蹤。術后2、4周處死受體小鼠,觀察各組移植動脈的病理改變,用掃描電鏡和Evans blue染色方法評價術后14天內皮損傷修復情況;并用計算機圖像分析系統(tǒng)測量術后4周移植動脈內膜增生情況。
　　 結果:骨髓源性單個核細胞體外可誘導培養(yǎng)出EPCs,表現為其細胞表面既表達干細胞標記(Sca-1),也表達內皮細胞特異性

10、標記(Flk-1,CD31,vWf等),并具有內皮細胞的生物學功能。CM-DiI標記的EPCs移植后主要定位于移植動脈損傷內膜部位。術后2周,EPCs移植組移植動脈內皮損傷較對照組明顯加重。術后4周,EPCs移植組移植動脈新生內膜厚度較對照組明顯增加,管腔狹窄程度顯著加重。
　　 結論:EPCs參與移植動脈新生內膜形成,受體骨髓源性EPCs可加重移植動脈內膜損傷,對移植性動脈硬化起促進作用。
　　 第三部分Vandeta

11、nib對EPCs數量和生物學功能的抑制作用及機制
　　 目的:檢測VEGFR-2在EPCs中的表達,并觀察VEGFR-2抑制劑Vandetanib對骨髓單個核細胞向EPCs分化以及EPCs增殖、黏附和遷移等生物學功能的抑制作用及機制。
　　 方法:采用密度梯度離心法從小鼠骨髓獲取單個核細胞,將其接種在纖維連接素包被的培養(yǎng)板,加入不同濃度Vandetanib,培養(yǎng)7天后,在倒置熒光顯微鏡下對EPCs進行計數,觀察Vande

12、tanib對骨髓單個核細胞向EPCs分化的影響。收集誘導培養(yǎng)7天的EPCs,按不同Vandetanib干預濃度進行分組,分別用細胞計數、MTT比色法、改良的Boyden小室及黏附能力測定檢測Vandetanib對EPCs增殖、遷移和黏附能力的影響。Western blotting法檢測EPCs在不同濃度Vandetanib干預后VEGFR-2和pVEGFR-2,Akt和pAkt,Erk和pErk等蛋白表達變化。
　　 結果:Va

13、ndetanib顯著抑制骨髓單個核細胞向EPCs分化。Vandetanib對EPCs的增殖、黏附和遷移能力也有明顯抑制作用,并具有濃度和時間依賴性。Western blotting法檢測結果顯示EPCs表達VEGFR-2,VEGF可刺激EPCs VEGFR-2的磷酸化。Vandetanib能阻斷VEGF誘導的EPCs VEGFR-2的活化,并降低其下游信號分子Akt及Erk磷酸化水平。
　　 結論:Vandetanib可阻止骨髓

14、單個核細胞向EPCs分化,并明顯抑制EPCs的增殖、黏附及遷移等生物學功能。Vandetanib的這一作用可能與直接阻斷VEGFR-2的活化及下游Akt和Erk信號通路有關。
　　 第四部分:vandetallib抑制EPCs對移植性動脈硬化的影響
　　 目的:觀察VEGFR-2抑制劑Vandetanib對小鼠移植動脈模型外周血EPCs數量的抑制作用及移植動脈新生內膜形成的影響,探討Vandetanib具有抗移植性動脈硬

15、化作用及可能機制。
　　 方法:采用C57BL/6小鼠為供體,BALB/c小鼠為受體,建立同種異品系腹主動脈移植模型。術后將實驗動物隨機分為3組:①移植對照組;②Vandetanib小劑量干預組(25mg/kg.d);③Vandetanib大劑量干預組(100mg/kg.d)。流式細胞儀分別檢測術前及術后1、3、7、14及28天外周血EPCs數量變化;掃描電鏡和Evans blue染色方法評價術后14天內皮損傷修復情況;光鏡下觀

16、察各組移植動脈術后4周的病理改變,并用計算機圖像分析系統(tǒng)分析移植動脈新生內膜增生情況。
　　 結果:Vandetanib明顯降低腹主動脈移植術后早期外周血EPCs數量,術后2周、4周外周血EPCs數量仍維持在較低水平,其中大劑量干預組EPCs數量減少更加顯著。術后2周,掃描電鏡和Evans blue染色均提示Vandetanib干預組移植動脈內皮損傷較對照組減輕。移植術后4周,Vandetanib大劑量干預組移植動脈內膜增生厚度