IGF1R信號通路在心外膜祖細胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、心外膜祖細胞被證實在心臟發(fā)育過程中起著重要作用，它能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）形成心外膜來源細胞（EPDCs），并在一系列的信號通路作用下最終分化為心臟成纖維細胞以及冠脈血管平滑肌細胞，參與心臟纖維骨架和冠脈血管的形成。因其具有多項分化潛能，心外膜祖細胞被認為是心臟的第三心生區(qū)，是一個能特征性表達Tbx18、Wt1和Tcf21等基因的祖細胞池。成年心臟的心外膜細胞喪失心外膜祖細胞的特征，但有研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后梗死區(qū)周邊處于靜止期的心外膜

2、細胞可再次激活，重新表達胚胎期心外膜祖細胞基因，如Tbx18和Wt1，并不斷增殖、EMT、遷移進入梗死區(qū)域參與心臟修復(fù)及血管再生。因此，研究心外膜祖細胞增殖以及EMT機制不僅對于深入探索心臟生長發(fā)育機制具有重要的意義，且有助于推進心外膜祖細胞在心臟再生領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用。胰島素樣生長因子1型受體（IGF1R）介導(dǎo)的信號通路已經(jīng)被證實參與多種細胞的增殖以及EMT過程，并且有研究通過原位雜交的方式證實在E11.5-E14.5天心外膜上有IGF1

3、R基因的表達，我們猜測此信號通路可能參與調(diào)控心外膜祖細胞的增殖以及EMT過程。IGF1R參與調(diào)控細胞增殖以及EMT的作用除了通過傳統(tǒng)經(jīng)典的PI3K/AKT以及MAPK/ERK途徑實現(xiàn)外，近年來發(fā)現(xiàn)其也可通過FAK途徑產(chǎn)生相似的生理或者病理作用，因此，我們通過本實驗研究探索IGF1R信號通路在心外膜祖細胞增殖以及EMT中的作用，以及探討其相關(guān)作用是否通過FAK介導(dǎo)實現(xiàn)。
　　第一部分、IGF1R信號通路在小鼠胚胎心臟組織中的時空表達

4、
　　目的：探索IGF1R及其主要配體IGF1和IGF2在小鼠胚胎心臟組織中的時空表達情況。
　　方法：雌性及雄性C57BL/6小鼠進行交配，取E11.5-E17.5天的胚胎組織進行冰凍切片，免疫熒光染色確定IGF1R及其配體IGF1和IGF2在E11.5-E17.5天胚胎心臟中的表達情況。
　　結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果提示IGF1R在E11.5-E17.5天的胚胎心外膜上有明確表達。IGF1在E11.5-E13.5天的

5、胚胎心外膜上表達量較少，在E14.5-E17.5天的胚胎心外膜上明顯表達。作為胚胎期生長因子，IGF2在胚胎心外膜的表達比IGF1更加明顯且高表達貫穿E11.5-E17.5天。
　　結(jié)論：IGF1R及其配體IGF1和IGF2在E11.5-E17.5天的胚胎心外膜上均有表達，提示IGF1R信號通路可能參與調(diào)控小鼠心外膜祖細胞的發(fā)育過程。
　　第二部分、IGF1R信號通路在心外膜祖細胞增殖中的作用及機制研究
　　目的：建立

6、小鼠心外膜祖細胞體外培養(yǎng)體系，并通過干預(yù)細胞IGF1R信號通路，研究IGF1R信號通路是否參與調(diào)控心外膜祖細胞的增殖，并深入探討其調(diào)控增殖作用是否通過FAK介導(dǎo)實現(xiàn)。
　　方法：雌性及雄性C57BL/6小鼠進行交配，取E12.5d的胚胎心臟組織進行心外膜祖細胞培養(yǎng)，使用免疫熒光染色技術(shù)檢測其特異性標(biāo)志物Tbx18和Wt1的表達情況來進行細胞鑒定。同時也通過免疫熒光染色檢測IGF1R在體外培養(yǎng)的原代小鼠心外膜祖細胞中的表達情況。然后

7、分別用不同濃度的Picropodophyllin（PPP）（0、0.2μM、0.4μM、0.8μm和1.6μM）干預(yù)原代心外膜祖細胞72小時，CCK-8（Cell Counting Kit-8）檢測細胞增殖情況。然后將體外培養(yǎng)的原代心外膜祖細胞隨機分為兩組：對照組和PPP組（給予0.4μM PPP干預(yù)）。培養(yǎng)72小時后，使用免疫熒光染色檢測兩組細胞增殖標(biāo)志物Ki67的表達以及FAK（pY397）磷酸化水平；qRT-PCR測定Ki67、C

8、CND1（細胞周期蛋白CyclinD1編碼基因）以及Ptk2和Ptk2b（FAK編碼基因）在mRNA水平的表達情況，并通過流式細胞技術(shù)檢測兩組細胞之間細胞周期的變化?？紤]到血清之中含有胰島素樣生長因子，將原代心外膜祖細胞培養(yǎng)基中的胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）由10%降至1%。然后，分別用不同濃度的IGF1（0、5ng/ml、10ng/ml和50ng/ml）和IGF2（0、10ng/ml、50ng/ml和100

9、ng/ml）干預(yù)細胞72h，CCK-8檢測細胞增殖情況。并將細胞隨機分為：對照組、IGF1組（50ng/ml）、IGF2組（100ng/ml）、IGF1+Y15組（50ng/ml IGF1+1nM Y15）和 IGF2+Y15組（100ng/ml IGF2+1nM Y15）。CCK-8檢測各組細胞增殖能力，免疫熒光染色檢測Ki67表達以及FAK（pY397）磷酸化情況，qRT-PCR檢測Ki67、CCND1、Ptk2和Ptk2在mRNA

10、水平的表達情況，流式細胞技術(shù)檢測各組細胞周期變化。
　　結(jié)果：培養(yǎng)出來的細胞在倒置細胞顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石”樣外觀，形態(tài)規(guī)則、單一，細胞間連接緊密，細胞核內(nèi)特異性表達Tbx18及Wt1，且陽性細胞數(shù)高。細胞免疫熒光染色提示小鼠心外膜祖細胞膜上點狀分布IGF1R。CCK-8實驗結(jié)果提示隨著PPP濃度的增加，心外膜祖細胞增值能力逐漸降低。與對照組相比，免疫熒光染色顯示PPP組細胞Ki67表達、FAK（pY397）磷酸化水平明顯下降，q

11、RT-PCR提示干預(yù)組細胞Ki67、CCND1、Ptk2以及Ptk2b mRNA表達明顯降低，流式細胞周期檢查結(jié)果提示PPP組細胞中處于G1期的細胞明顯增加，S和G2期細胞則明顯減少。不同濃度的IGF1和IGF2干預(yù)細胞72后，隨著生長因子濃度的增加，心外膜祖細胞的增殖能力逐漸升高。與對照組相比，IGF1與IGF2組細胞Ki67表達以及FAK(pY397)磷酸化水平明顯增高，Ki67、CCND1、Ptk2和Ptk2b mRNA的表達也明

12、顯升高，G1期細胞減少，S、G2期細胞增多；使用Y15特異性阻斷FAK（pY397）磷酸化后，Ptk2和Ptk2b在mRNA水平的表達不受影響，但引起Ki67、CCND1在mRNA水平的表達明顯降低，CCK-8顯示細胞增殖能力明顯受限，流式細胞周期檢查則提示細胞由G1期向S/G2期的轉(zhuǎn)化被明顯抑制。
　　結(jié)論：我們成功建立了心外膜祖細胞的體外培養(yǎng)體系，并證實IGF1R信號通路可參與調(diào)控心外膜祖細胞的增殖，且此作用可通過FAK介導(dǎo)實

13、現(xiàn)。
　　第三部分、IGF1R信號通路在心外膜祖細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究
　　目的：探索IGF1R信號通路是否能夠影響心外膜祖細胞EMT過程。
　　方法：同上，將體外培養(yǎng)的心外膜祖細胞隨機分為兩組：對照組和PPP組（給予0.4μM PPP干預(yù)）。培養(yǎng)72小時后，使用免疫熒光染色檢測細胞上皮標(biāo)志物ZO-1以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達情況；qRT-PCR測定Cdh1（上皮標(biāo)志物E-cadherin編碼基因）、T

14、jp1（ZO-1編碼基因）、Cdh2（間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin編碼基因）以及Vim（Vimentin編碼基因）在mRNA水平的表達情況。將心外膜祖細胞的培養(yǎng)背景降低為1%FBS后，細胞隨機分為：對照組、IGF1組（50ng/ml）和IGF2組（100ng/ml）。免疫熒光染色檢測各組細胞ZO-1和Vimentin的表達情況，qRT-PCR檢測各組細胞Cdh1、Tjp1、Cdh2和Vim在mRNA水平的表達情況，以及Transwel

15、l實驗觀察三組細胞間遷移能力的差異。
　　結(jié)果：細胞免疫熒光染色及qRT-PCR的結(jié)果提示，對照組與PPP組細胞不論是ZO-1和Vimentin的表達還是Cdh1、Tjp1、Cdh2和Vim在mRNA水平的表達均無明顯差異。同樣地，IGF1與IGF2干預(yù)處理細胞也不能引起所檢測的EMT相關(guān)標(biāo)志物表達的明顯改變。Transwell試驗提示IGF1及IGF2并不影響細胞的遷移能力。
　　結(jié)論：IGF1R信號通路不影響心外膜祖細胞