GLUT1介導(dǎo)EF-24抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、肺癌(lung cancer)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的主要惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其死亡率位列惡性腫瘤首位，并且近年來(lái)其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。肺癌中以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)居多，占80％-85％，治療的手段主要是手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療為主的綜合治療。NSCLC的病因尚未明確，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，已有研究表明空氣污染、吸煙等環(huán)境因素以及遺傳因素

2、與其發(fā)病有關(guān)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同角度探討NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，這一點(diǎn)與正常細(xì)胞不同，而這一特性的獲得與癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取以及糖酵解代謝的增強(qiáng)有關(guān)。葡萄糖攝取量的增加和糖酵解能量代謝的增強(qiáng)不僅可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，而且還造成后期對(duì)放療、化療等治療方法的抵抗，所以傳統(tǒng)的腫瘤治療方式很難達(dá)到理想的效果。
　　葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transport protei

3、n，GLUT)是嵌入在細(xì)胞膜上，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體蛋白，在正常生理?xiàng)l件下葡萄糖需借助GLUT而被細(xì)胞所攝取。該家族的主要成員葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter protein1，GLUT1)是細(xì)胞糖代謝的主要限速蛋白，是體內(nèi)分布最廣的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幾乎在所有的腫瘤組織中均存在過(guò)度表達(dá)。GLUT1的過(guò)度表達(dá)使腫瘤細(xì)胞在缺血、缺氧的情況下得以高效攝取和利用葡萄糖，從而獲得更多的能量供應(yīng)，以維持腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)。研究表明

4、NSCLC細(xì)胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移性能與GLUT1的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)，而且與腫瘤的大小、分化程度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
　　姜黃素(curcumin)是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根或莖中提取的一種有效植物多酚，它具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎癥反應(yīng)的多重生物學(xué)效應(yīng)。2004年Adams等人在姜黃素分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一百多種姜黃素衍生物，它們大部分都具有抗腫瘤的作用機(jī)制，其中聯(lián)苯二氟酮(Diphenyl difluoroket

5、one，EF-24)的作用最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)EF-24對(duì)大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞株，與胃癌、腸癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等相關(guān)，都有明顯的抑制作用，其效果至少是姜黃素的10余倍。EF-24在治療前列腺癌和乳腺癌時(shí)可以直接抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducefactor-1α，HIF-1α)的轉(zhuǎn)錄活性，從而使腫瘤細(xì)胞中HIF-1α介導(dǎo)的調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的相關(guān)基因上調(diào)，促使腫瘤在低氧時(shí)采用糖酵解途徑。并且EF-

6、24在卵巢癌細(xì)胞研究中可以抑制GLUT1介導(dǎo)的代謝，從而抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。
　　鑒于此，我們?cè)O(shè)想以GLUT1為切入點(diǎn)，利用Western-blotting、RT-PCR檢測(cè)EF-24對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞GLUT1蛋白及基因的影響;觀察EF-24在不同濃度對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活性的影響;利用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以及建立裸鼠皮下移植瘤的動(dòng)物模型，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察EF-24對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響;通過(guò)觀

7、察EF-24在細(xì)胞水平、機(jī)體水平對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖活性以及糖酵解中糖代謝和GLUT1表達(dá)的影響，研究EF-24與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為有效防治非小細(xì)胞肺癌提供藥物治療的新靶點(diǎn)。
　　目的:
　　1.明確NSCLC患者的肺部癌組織、癌旁組織以及正常肺組織中GLUT1的轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平的表達(dá)情況;
　　2.以GLUT1為切入點(diǎn)，不同濃度的EF-24處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，通過(guò)MMT實(shí)

8、驗(yàn)明確EF-24對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響;
　　3.研究EF-24與NSCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為有效防治肺癌提供藥物治療新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.收集NSCLC患者的臨床新鮮手術(shù)組織標(biāo)本，如正常組織標(biāo)本、成對(duì)肺癌組織、癌旁組織。所取臨床標(biāo)本經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審計(jì)批準(zhǔn)。
　　2.應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)、免疫組化的方法來(lái)明確NSCLC組織結(jié)構(gòu)中GLUT1的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理結(jié)果分析GLUT1的表

9、達(dá)與NSCLC臨床病理分級(jí)的關(guān)系。
　　3.利用不同濃度的EF-24處理NSCLC A549細(xì)胞系，應(yīng)用RT-PCR、免疫印跡、熒光報(bào)告分析等實(shí)驗(yàn)來(lái)明確GLUT1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)情況，并結(jié)合細(xì)胞周期分析、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性等方法進(jìn)一步評(píng)估此現(xiàn)象。
　　4.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的方法，通過(guò)細(xì)胞體外、裸鼠體內(nèi)2種實(shí)驗(yàn)來(lái)分析GLUT1對(duì)A549細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖能力的影

10、響。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（(x)±s）。兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較應(yīng)用t-test，多組之間等級(jí)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用方差分析、Tukey檢驗(yàn)。P值＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.在患者肺組織標(biāo)本中，通過(guò)RT-PCR、免疫印跡技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)的癌旁組織、正常肺組織比較，肺腫瘤組織中GULT1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄及

11、翻譯水平均明顯上調(diào)，并與腫瘤的臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。
　　2.本研究通過(guò)在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染GLUT1 siRNA及shRNA將GLUT1基因沉默，并經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)了GLUT1基因的沉默能夠引起A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力減低。另外，通過(guò)在裸鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，A549細(xì)胞被轉(zhuǎn)染GLUT1 shRNA注射入裸鼠體內(nèi)，7周后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，腫瘤的體積明顯縮小，這進(jìn)一步證實(shí)沉默GLUT1基因可以顯著抑制肺癌

12、細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，我們認(rèn)為GLUT1被沉默后A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和成瘤能力均受到顯著抑制，從而反向證明了GLUT1促進(jìn)A549細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖能力。
　　3.利用不同濃度EF-24處理A549細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡技術(shù)，結(jié)果表明在A549細(xì)胞中的EF-24可以顯著減少GLUT1的表達(dá)，并且這種下降呈明顯的梯度依賴性，與EF-24的藥物濃度成正比。
　　4.通過(guò)采用不同濃度的EF-24分別處理A549細(xì)胞，檢測(cè)A549細(xì)胞中葡萄糖的

13、吸收和糖酵解的速度、觀察Transwell細(xì)胞遷移、侵襲及用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，我們發(fā)現(xiàn)EF-24可以抑制A549細(xì)胞的糖酵解途徑及抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GLUT1在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)顯著高于相鄰癌旁組織和正常的肺組織;
　　2.本研究證明EF-24可以抑制GLUT1基因在A549細(xì)胞系的表達(dá)，從而影響NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的糖酵解途徑及遷移侵襲，進(jìn)而抑制NSCLC