新型雷帕霉素微粒釋藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用研究.pdf

1、心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是導(dǎo)致人類死亡和勞動(dòng)力喪失的重要因素，其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)超越腫瘤位居第一。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是引起冠狀動(dòng)脈疾病、中風(fēng)等多種心血管疾病的共同的病理基礎(chǔ)，是當(dāng)前人類需要攻克的一大難題。AS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，致病因素較多，目前以他汀類為代表的降脂藥物被廣泛應(yīng)用于臨床治療，盡管取得了一定效果，但是CVD的發(fā)病率和致死率依然逐年上升，同時(shí)長期給

2、藥帶來的不良反應(yīng)也對(duì)患者造成較大困擾，因此尋找有效的治療藥物、構(gòu)建適宜的藥物遞送系統(tǒng)對(duì)于防治CVD具有重要意義。
　　雷帕霉素(Rapamycin，RAP)因具有良好的抗增殖活性被廣泛用于器官移植后抗排斥反應(yīng)和抑制冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄。RAP的靶點(diǎn)為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)，它是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白、能量水平的重要因子。通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路，RAP具有

3、抗炎、抑制平滑肌細(xì)胞增生、遷移和促進(jìn)自噬選擇性殺滅巨噬細(xì)胞等多重作用，因而具有潛在的抗AS作用。目前對(duì)于RAP在動(dòng)物體內(nèi)抗AS作用還不明確，其AS防治作用有待進(jìn)一步確證。另一方面，RAP較強(qiáng)的疏水性導(dǎo)致其傳統(tǒng)劑型給藥后生物利用度低，不利于其療效的發(fā)揮。同時(shí)，RAP的傳統(tǒng)劑型在釋放時(shí)間和釋放位點(diǎn)兩個(gè)方面的控制均不理想，限制了其療效的發(fā)揮，亦會(huì)帶來較大的不良反應(yīng)。因而，構(gòu)建適用于不同給藥途徑的、具有良好臨床應(yīng)用前景的新型RAP釋藥系統(tǒng)，對(duì)于

4、發(fā)揮RAP的有效活性意義重大。
　　目的：
　　構(gòu)建不同的RAP微粒釋藥系統(tǒng)，以為其療效的最大化發(fā)揮提供潛在的新型藥物制劑。為此，首先在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)了RAP的抗AS作用;然后，通過主-客體作用介導(dǎo)的自組裝方法構(gòu)建了RAP口服微粒系統(tǒng)，通過縮醛化β-環(huán)糊精材料構(gòu)建了適用于局部注射給藥的RAP緩釋微粒，并通過具有病灶微環(huán)境響應(yīng)性的功能化β-環(huán)糊精材料構(gòu)建了靶向性RAP納米釋藥系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的RAP制劑相比，這些不同的釋藥系統(tǒng)各具優(yōu)

5、勢，并能更好地發(fā)揮RAP的抗AS作用，為其臨床防治AS的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也為RAP的臨床應(yīng)用提供了多種新型的候選劑型。
　　方法：
　　1.載體材料的合成
　　1.1.聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)的合成
　　1.2.縮醛化β-環(huán)糊精(Ac-bCD)的合成
　　1.3.氧化響應(yīng)性β-CD(Ox-bCD)的合成
　　上述制備的材料均通過氫核磁共振光譜法(1H NMR)和傅立葉變換紅外

6、光譜法(FTIR)確證其結(jié)構(gòu)，凝膠滲透色譜法(GPC)測定分子量。
　　2.載藥微粒的制備
　　2.1.口服微粒系統(tǒng)的制備
　　2.2.RAP緩釋微粒的制備
　　2.3.響應(yīng)性RAP載藥納米粒的制備
　　3.載藥微粒的表征
　　稱取少量樣本分散于水中，吸取足量混懸液滴于銅網(wǎng)膜和云母片上，室溫?fù)]干，分別進(jìn)行透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察。將剩余混懸液稀釋后加入比色杯中，通過動(dòng)態(tài)光散射法測定樣

7、品的粒徑大小及其分布。另稱取少量樣本溶于DMSO中，紫外分光光度計(jì)法(UV)或液相色譜法(HPLC)測定RAP的含量，計(jì)算其載藥量和包封率。
　　4.藥物與載體材料間分子作用力的研究
　　通過計(jì)算模擬分析RAP與載體材料PNIPAm間的相互作用，采用MOE軟件生成RAP、PNIPAm三維構(gòu)象，從Zinc數(shù)據(jù)庫中下載得到IND構(gòu)象，應(yīng)用MMFF94x力場進(jìn)行能量最小化分析，采用Autodock對(duì)PNIPAm、RAP、IND和水

8、分子之間的相互作用力進(jìn)行兩兩或者多分子對(duì)接，采用LGA算法計(jì)算分子間結(jié)合能大小。
　　5.RAP載藥微粒的體外釋放動(dòng)力學(xué)研究
　　稱取適量載藥微?；鞈矣诓煌琾H值的PBS或含有H2O2的PBS中，置于37℃孵箱中，不同時(shí)間點(diǎn)離心后取出部分釋放液，再分散后加入同等體積的新鮮溶液。測定藥物濃度，Origin軟件繪制藥物累積釋放曲線。
　　6.載藥微粒的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究
　　7.AS模型的建立及不同治療方案
　　8

9、.主動(dòng)脈斑塊面積分析
　　9.主動(dòng)脈切片的組化分析
　　10.小鼠血清中炎癥因子的測定
　　11.RAP對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用研究
　　12.主動(dòng)脈組織ROS水平的測定
　　13.響應(yīng)性納米粒靶向AS斑塊的評(píng)價(jià)
　　14.微粒釋藥系統(tǒng)的初步安全性評(píng)價(jià)
　　結(jié)果：
　　1.通過自由基聚合合成了PNIPAm，GPC測得其分子量為53973。采用MP為縮醛化試劑，通過動(dòng)力學(xué)控制的縮醛化反應(yīng)成功

10、合成了縮醛化β-CD(Ac-bCD)，其中線性與環(huán)狀縮醛基團(tuán)的摩爾比為0.62∶1;通過將PBAP化學(xué)鍵合于β-CD，制備得到了氧化響應(yīng)性的β-CD材料(Ox-bCD)，其中每個(gè)β-CD單元含有11個(gè)PBAP單元。
　　2.基于IND或SUL介導(dǎo)的PNIPAm的自組裝成功將RAP負(fù)載于微粒中，得到平均粒徑在600-800 nm的載藥微粒;其載藥量隨著投藥比的增加而升高，最高接近60％;通過乳化法制備的PLGA和Sl00載藥微粒，平

11、均粒徑在600 nm，其RAP載藥量分別為18.1％和17.2％。分子間動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明RAP、IND、PNIPAm之間存在疏水作用，氫鍵作用、范德華力和靜電作用，因此能夠克服RAP分子間自身的結(jié)晶力，使RAP以無定型的形式被包裹于聚合物中，從而更有利于藥物的溶出，提高其體內(nèi)生物利用度。
　　3.采用水包油乳化法成功將RAP包裹于Ac-bCD微粒中得到RAP-NP，其平均粒徑為250nm，載藥量27.2％，SEM和TEM觀察表明

12、RAP-NP呈規(guī)則球狀，且分散均勻。
　　4.以PLGA、Ac-bCD和Ox-bCD分別為疏水載體材料，采用納米沉淀-自組裝法成功制備得到具有不同響應(yīng)性的RAP納米粒，即RAP/PLGA NP、RAP/Ac-bCD NP和RAP/Ox-bCD NP，三種納米粒的平均粒徑均在250nm左右，載藥量分別為8.0％、12.5％和7.0％，SEM和TEM觀察表明，納米粒均呈規(guī)則球形、分散均勻。
　　5.體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，在pH7.4

13、的PBS中，載RAP的PLGA和S100微粒24小時(shí)藥物累積量為50％，而自組裝RAP/PNIPAm微粒同時(shí)間段的釋放量為70％。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究表明，自組裝RAP微粒組具有顯著增加的口服生物利用度，其血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)是PLGA和S100微粒的2倍。
　　6.在pH7.4的PBS中，RAP-NP能夠持續(xù)釋放32天，且是要速率較為恒定;在小鼠體內(nèi)，RAP-NP皮下注射后可持續(xù)釋放22天，其血藥濃度長時(shí)間維持在50 n

14、g/L。與此對(duì)應(yīng)，小鼠皮下注射RAP-NP能夠長時(shí)間保持主動(dòng)脈組織中RAP的濃度在1.2ng/g。
　　7.PAP/Ac-bCD NP的釋放具有明顯的pH依賴性，其在pH5的釋放速率顯著快于pH7.4對(duì)應(yīng)的釋放速率。另一方面，PBS中加入1 mM H2O2能夠顯著加速RAP/Ox-bCD NP的釋藥，表明其具有較好的氧化響應(yīng)性。微酸性條件和H2O2的存在對(duì)RAP/PLGA NP的體外釋放無明顯影響。
　　8.ApoE/-小鼠

15、高脂喂養(yǎng)三個(gè)月后，對(duì)照組主動(dòng)脈竇附近能夠形成肉眼可見的白色斑塊，表明AS模型建立成功。與對(duì)照組相比，RAP原料藥能夠明顯抑制AS斑塊的生長，降低斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的水平、升高斑塊外周膠原含量，從而提高斑塊穩(wěn)定性。
　　結(jié)論：
　　1.口服后，高劑量的RAP原料藥能夠有效抑制ApoE-/-小鼠AS斑塊的生長、提高斑塊的穩(wěn)定性，表現(xiàn)在主動(dòng)脈斑塊面積的減小、斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和MMP-9水平的降低、以及斑

16、塊外周膠原含量的升高。
　　2.通過含羧基小分子化合物介導(dǎo)的PNIPAm的自組裝，可以制備RAP載藥微粒，實(shí)現(xiàn)RAP的高效負(fù)載;同時(shí)因各分子間作用力大于藥物分子結(jié)晶力，使得RAP分子以無定形狀態(tài)包裹于微粒中，因而具有良好的藥物溶出度，口服給藥后比對(duì)照微粒系統(tǒng)具有更高的生物利用度。與此對(duì)應(yīng)，自組裝RAP微粒比同劑量的PLGA和S100微粒具有更有效的抗AS作用。因此，自組裝RAP微粒有望為RAP的臨床應(yīng)用提供一種理想的口服制劑。

17、r>　　3.通過縮醛化反應(yīng)成功制備了新型載體材料Ac-bCD，采用水包油乳化法制備得到具備優(yōu)越緩釋性能的RAP-NP，它能維持血藥濃度長時(shí)間穩(wěn)定在較低水平，在這種藥物作用方式下RAP-NP能夠選擇性抑制mTORC1;原料藥因其較高的血藥濃度能夠同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2信號(hào)通路。與口服RAP原料藥相比，RAP-NP緩釋微粒具有更加優(yōu)異的抗AS作用。
　　4.通過將氧化敏感性的基團(tuán)化學(xué)鍵合于β-CD成功制備了新型氧化敏感性載