高遷移率族蛋白B1對(duì)小鼠調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他全身炎癥的致死性效應(yīng)，研究其病理生理作用與意義將有助于深化對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為免疫反應(yīng)的調(diào)控提供潛在的干預(yù)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)擬采用HMGB1體外刺激小鼠脾臟調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞（DCreg），重點(diǎn)圍繞HMGB1對(duì)DCreg免疫功能的影響及其受體機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和治療提供新思路。
　　方法：1.分離培養(yǎng)正常Balb/

2、c小鼠脾臟DCreg（CD11clowCD45RBhighDCs），采用不同劑量的HMGB1（10、100、1000ng/ml）刺激12小時(shí)，并以100ng/mlHMGB1于不同時(shí)間點(diǎn)（2、12、24小時(shí)）刺激，觀察HMGB1刺激與DCreg分泌白細(xì)胞介素（IL）-10和IL-12水平、表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合物（MHC）-II表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。采用ELISA法檢測(cè)上清中IL-1

3、0和IL-12水平，DCreg共刺激分子表達(dá)采用流式細(xì)胞儀分析。2.DCreg經(jīng)100ng/ml的HMGB1刺激12小時(shí)后，與脾T淋巴細(xì)胞以1:100的細(xì)胞比例混合培養(yǎng)，于共同作用后3天觀察T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化（Th1/Th2）、IL-2表達(dá)情況。3.HMGB1刺激后，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和PCR技術(shù)檢測(cè)DCreg表面Toll樣受體（TLR）4的表達(dá)，進(jìn)一步觀察封閉TLR4受體對(duì)HMGB1刺激后DCreg分泌IL-10和IL-1

4、2水平、以及對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化、IL-2表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1.HMGB1對(duì)小鼠脾臟DCreg功能的影響：（1）HMGB1刺激后，DCreg分泌IL-10、IL-12水平于12~24小時(shí)分別明顯升高和下降（P<0.01），其中以作用12小時(shí)后達(dá)穩(wěn)態(tài)；10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1刺激均可誘導(dǎo)DCregIL-10、IL-12分泌水平分別明顯上升和下降（P<0.01），其中HMGB1

5、的濃度為100ng/ml時(shí)，DCreg分泌IL-10、IL-12趨于穩(wěn)定。（2）與正常對(duì)照組相比，100ng/ml的HMGB1刺激DCreg12小時(shí)后，表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-II表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.01）。2.HMGB1誘導(dǎo)的DCreg對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞功能的影響：HMGB1誘導(dǎo)的DCreg與T淋巴細(xì)胞以1:100的比例相互作用3天，與對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刺激的增殖反應(yīng)明顯減弱，上清液中干擾素

6、（IFN）-γ/IL-4比值顯著降低，IL-2水平明顯降低（P<0.01）。3.HMGB1介導(dǎo)小鼠脾臟DCreg作用的受體機(jī)制：（1）100ng/mlHMGB1刺激12小時(shí)后，DCreg表面TLR4表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）；（2）拮抗TLR4后，HMGB1刺激的DCreg分泌IL-10、IL-12水平與對(duì)照組比較變化不明顯，T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化、IL-2水平亦未見(jiàn)顯著改變（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.HMGB1能