高遷移率族蛋白B1對(duì)小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白Bl(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察體外刺激小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)而闡明HMGBl對(duì)該細(xì)胞免疫功能的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。旨在為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及感染后期嚴(yán)重膿毒癥的預(yù)防和治療提供新思路。 方法：斷頸處死小鼠無菌取脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞。①采用免疫磁珠法分離獲取正常BALB/c小鼠脾臟CD4+T，CD46CD25-T細(xì)胞及CD4+

2、CD25+Treg，鑒定細(xì)胞純度。②分別以植物凝集素(PHA)、刀豆素A(ConA)及固相包被抗-CD3這三種不同的刺激劑誘導(dǎo)活化Treg，觀察T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)及叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)表達(dá)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。③將Treg依HMGB1(100ng/

3、ml)刺激時(shí)間不同設(shè)為24h組、48h組、72h組觀察HMGBl刺激與CTLA-4及Foxp3表達(dá)的時(shí)間.效應(yīng)關(guān)系。將Treg依HMGBl濃度不同設(shè)為0ng/ml組(對(duì)照組)、10ng/ml組、100ng/ml組、1000ng/ml組，72h后用流式細(xì)胞儀分析CTLA-4、Foxp3表達(dá)情況及對(duì)IL-10分泌的影響(劑量.效應(yīng)關(guān)系)。④分別提取CD4+CD25+Treg及CD4+CD25-T細(xì)胞，設(shè)單純CD4+CD25-對(duì)照組，另依CD

4、25+：CD25-比例分設(shè)1:1組、1:5組、1:10組、1:20組，通過MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)CD4+CD25+Treg對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞抑制的細(xì)胞比例關(guān)系。⑤HMGBl刺激Treg72h。刺激后細(xì)胞依CD25+：CD25-比例設(shè)1:1及1:5組。各組分設(shè)CD25-組、未刺激Treg組及HMGBl-Treg組。通過MTT比色試驗(yàn)分析HMGBl刺激對(duì)Treg細(xì)胞抑制功能的影響。⑥SYBRGREEN法測(cè)定HMGBl刺激與Foxp3基因

5、表達(dá)的時(shí)間、劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑦分別留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法測(cè)定不同細(xì)胞因子的變化情況。 結(jié)果：1.小鼠CD4+CD25+Treg純度分析：多次細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)證實(shí)，正常小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過MACS兩次分選后，CD4+CD25+T細(xì)胞純度可達(dá)到91.74％～98.14％，其中CD25-細(xì)胞低于3％：CD4+CD25-T細(xì)胞純度達(dá)88.73％～93.85％，其中CD25+細(xì)胞少于1％。所獲得的CD4+CD25+T細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)

6、活性大于97％。2.PHA對(duì)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞無明顯活化作用，CTLA-4及Foxp3表達(dá)與對(duì)照組比較平均熒光強(qiáng)度沒有明顯差異(P＞0.05)。而ConA刺激TregCTLA-4的表達(dá)上調(diào)呈一過性，作用持續(xù)時(shí)間不超過48h，且對(duì)于Foxp3的表達(dá)也無明顯的影響?？?CD3則能夠較好地活化Treg，表現(xiàn)為CTLA-4及Foxp3表達(dá)在24～72h均明顯增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)，其中24、48h表達(dá)上調(diào)更為明顯(P＜

7、0.01)，并可延續(xù)至刺激后72h。3.HMGB1刺激Treg，CTLA.4表達(dá)在24～72h均有所下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48、72h表達(dá)下調(diào)尤為明顯(P＜0.01)；而不同劑量HMGBl(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)刺激均可誘導(dǎo)CTLA-4表達(dá)下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中HMGBl濃度在1000ng/ml時(shí)其表達(dá)減弱最明顯。Foxp3表達(dá)與CTLA-4呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。細(xì)胞

8、培養(yǎng)上清中IL-10水平呈現(xiàn)與HMGB1的劑量依賴關(guān)系，即HMGBl刺激濃度越高IL-10水平下降越明顯。4.CD4+CD25-T細(xì)胞在活化后表現(xiàn)出增殖反應(yīng)，但隨Treg比例增加，CD4+CD25-T細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制。當(dāng)細(xì)胞比例達(dá)到1:1時(shí)表現(xiàn)為對(duì)其抑制效應(yīng)達(dá)到90％左右。當(dāng)加入HMGBl(1000ng/ml)刺激的Treg時(shí)，CD4+CD25-T細(xì)胞增殖受抑程度減輕。這～現(xiàn)象在細(xì)胞比例為1:1及1:5組均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。5.經(jīng)HMG

9、Bl刺激后的TregFoxp3mRNA表達(dá)分別于24～72h明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48、72h后表達(dá)下降尤為顯著(P＜0.01)；給予HMGBl刺激72h后，10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGBl刺激均可誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)減弱(P＜0.0或P＜0.01)，其中HMGBl的濃度在1000ng/ml時(shí)Foxp3表達(dá)下調(diào)最明顯。6.與正常對(duì)照組比較，不同時(shí)間及劑量HMGBl體外刺激Treg

10、，其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10水平隨HMGBl刺激時(shí)間延長(zhǎng)及濃度增高而下降明顯(P＜0.05或P＜0.01)。將CD4+CD25-T細(xì)胞中加入Treg共培養(yǎng)后，CD4+CD25-T細(xì)胞上清中IL-2、IFN-γ水平明顯下降，而當(dāng)加入HMGBl刺激的Treg后，隨HMGBl刺激濃度增加，二者生成受抑制的程度明顯逆轉(zhuǎn)(P＜0.05或P＜0.01)。與對(duì)照組相比，Treg組IL-4/I

11、L-10生成明顯增加，而HMGBl-Treg組IL-4/IL-10水平下降并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)，且在HMGBl濃度為10ng/ml與100ng/ml時(shí)下降更為明顯(P＜0.01)。 結(jié)論：1.兩步法免疫磁珠分離CD4+CD25+Treg細(xì)胞，所得細(xì)胞純度高，細(xì)胞活力無影響，完全可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。2.在多種細(xì)胞刺激劑中，抗-CD3可以較好地活化Treg，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了可能。3.HMGBl可能通過