2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:建立SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)模型,確定最適的高糖作用濃度和作用時間;檢測高糖作用下海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK、p-ERK和MLCK的表達;探討高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元細胞MLCK與MAPK/ERK信號通路的相關性;初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表達下降的作用機制。
  方法:1.海馬神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)及鑒定:以25mM為基礎糖濃度培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,并用倒臵顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài);細胞培養(yǎng)至第7天,通過NSE免疫

2、組化染色鑒定海馬神經(jīng)元細胞的純度,并計算海馬神經(jīng)元細胞的純度;2.最適高糖濃度探索:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,將細胞懸液接種到96孔板中,細胞培養(yǎng)至第5天,將細胞分為25mM-24h組、25mM-48h組、25mM-72h組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組;達到各組相應的糖作用時間后,用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的OD值,計算各組海馬神經(jīng)元的活性,得出最適高糖作用濃度。3.最適高糖作用時間的探索:原代培養(yǎng)海

3、馬神經(jīng)元細胞,將細胞懸液接種到玻底培養(yǎng)皿中,將細胞分為25mM組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組;達到各組相應的糖作用時間后,進行免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元ERK、p-ERK和MLCK的表達,得出最適高糖作用時間。4.高糖作用后,海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK、p-ERK和MLCK的表達情況:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,細胞培養(yǎng)至第5天,將細胞分為對照組和高糖組;達到高糖作用的48h后,提取蛋白,B

4、CA蛋白定量后,Western Blot檢測ERK、p-ERK和MLCK的表達,并進行統(tǒng)計學分析。5. p-ERK和MLCK相關性的探討:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,細胞培養(yǎng)至第5天,將細胞分為高糖對照組、ERK抑制劑組和MLCK抑制劑組;其中ERK抑制劑組在高糖作用的同時加入ERK抑制劑PD98059作用24h,MLCK抑制劑組在高糖作用的同時加入MLCK抑制劑作用8h;高糖作用48h后,提取蛋白,BCA蛋白定量后,Western Blo

5、t檢測p-ERK和MLCK的表達,并進行統(tǒng)計學分析。6.二苯乙烯苷對海馬神經(jīng)元細胞的保護作用:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞,細胞培養(yǎng)至第5天,將細胞分為高對照組糖組、二苯乙烯苷低劑量組(TSG-L組TSG濃度為10μmol/L)、二苯乙烯苷中劑量組(TSG-M 組,TSG濃度為50μmol/L)和二苯乙烯苷高劑量組(TSG-H組,TSG濃度為100μmol/L);各組在高糖作用的同時加入相應濃度的二苯乙烯苷作用24h;高糖作用48h

6、后,提取蛋白,BCA蛋白定量后,Western Blot檢測各組海馬神經(jīng)元中p-ERK和MLCK的表達,并進行統(tǒng)計學分析。
  結果:1.海馬神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)及鑒定:海馬神經(jīng)元細胞接種后6h完全貼壁,生長良好,至7天基本發(fā)育成熟,經(jīng)鑒NSE染色鑒定細胞純度達90%以上,適合后續(xù)實驗。2.最適高糖濃度的探索:CCK-8結果顯示45mM組培養(yǎng)24h、48h、72h的海馬神經(jīng)元存活率>80%,屬1級細胞,可用于后續(xù)試驗;60mM組培

7、養(yǎng)24h、48h和72h后,海馬神經(jīng)元存活率均<80%,不能用于后續(xù)試驗。3.最適高糖作用時間的探索:激光共聚焦觀察海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),隨著糖濃度的升高,海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK熒光強度不變(P>0.05),p-ERK和MLCK熒光強度均升高(P<0.05),45mM-48h和45mM-72h組較45mM-24h組升高明顯(P<0.05),但45mM-48h組和45mM-72h組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.高糖作用后,海馬神經(jīng)元細

8、胞內(nèi)p-ERK和MLCK的表達情況:Western Blot結果顯示,與對照組相比,ERK表達無明顯變化(P>0.05),高糖組海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)p-ERK和MLCK表達明顯升高(P<0.01);5.高糖作用下,p-ERK與MLCK的關系探討:Western Blot結果顯示,與高糖組相比,MLCK抑制劑組MLCK表達降低(P<0.01),但p-ERK水平未有明顯變化(P>0.05);PD組MLCK表達及p-ERK水平均降低(P<0.01

9、),且兩者具有正相關性(r=0.878,P<0.01);6.二苯乙烯苷對海馬神經(jīng)元細胞的保護作用:Western Blot結果顯示,TSG-M組、TSG-H組MLCK表達及p-ERK表達均降低( P<0.05), MLCK表達與p-ERK變化水平呈正相關(r=0.829,P<0.01)。TSG-L組MLCK和p-ERK表達雖降低但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
  結論:1.糖濃度升高時海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK表達沒有變化,但

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