氧化應(yīng)激晶狀體上皮細(xì)胞中黏著斑激酶的表達(dá).pdf

1、背景：
　　 晶狀體上皮細(xì)胞((l)ens epithelial cells，LECs)是位于晶狀體前囊膜下的一層單層立方上皮細(xì)胞，其代謝活躍，具有生長(zhǎng)、分化和創(chuàng)傷刺激后發(fā)生愈合反應(yīng)的能力。晶狀體上皮細(xì)胞起到對(duì)晶狀體的營(yíng)養(yǎng)、代謝、損傷修復(fù)作用，是維持晶狀體透明性的最重要的防線，任何原因（如衰老、營(yíng)養(yǎng)代謝異常、中毒變性、外傷等）破壞LECs的正常結(jié)構(gòu)和功能，都可能導(dǎo)致不同類(lèi)型的晶狀體混濁。在既往的研究中，人們通過(guò)對(duì)比正常人與白內(nèi)障

2、患者的LECs，發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者LECs有三個(gè)特點(diǎn):形態(tài)改變、密度下降、局部增殖導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)層排列或向后囊移行。這些形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，是晶狀體發(fā)生渾濁的機(jī)制之一。因此，研究晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、凋亡等生物學(xué)特性是研究晶狀體疾病的重要基礎(chǔ)。
　　 白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展與晶狀體長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)有密切的聯(lián)系。通常認(rèn)為，過(guò)量的氧化應(yīng)激是外界各種致白內(nèi)障因素作用的共同途徑，它激活一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，最終因損傷LECs而導(dǎo)致晶狀體的渾濁

3、。在眾多導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的物質(zhì)中，過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是最重要的物質(zhì)。正常人的晶狀體及房水中存在一定數(shù)量的自由基，其中H2O2的濃度約為20-30μmol/L，而在白內(nèi)障患者的房水中可高達(dá)660μmol/L，為正?；颊叩?0倍。由于氧化應(yīng)激，LECs膜通透性改變，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)漏出，房水成分發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，穩(wěn)定性下降;細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞生理功能、透明度受到影響;DNA受損，晶狀體

4、上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而無(wú)法供給晶狀體代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加重氧化應(yīng)激的損害。這一系列的變化都能導(dǎo)致晶體的渾濁。氧化應(yīng)激激起了白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中惡性循環(huán)?？梢?jiàn)，H2O2誘導(dǎo)LECs的氧化損傷是白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的起始途徑，研究晶狀體上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制是研究年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要方面之一。
　　 黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種位于細(xì)胞質(zhì)的非受體型酪氨酸激酶。FAK自發(fā)現(xiàn)起至今已近2

5、0年，目前認(rèn)為FAK在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、遷移、抗凋亡、纖維化、分化方面都起到了一定的作用。(1)在細(xì)胞增殖方面，細(xì)胞與ECM的連接是細(xì)胞增殖的必要條件。整合素與細(xì)胞外基質(zhì)連接后，在生長(zhǎng)因子的刺激下，F(xiàn)AK被激活，通過(guò)MAPK或PI3K的激活促進(jìn)細(xì)胞增殖。(2)在細(xì)胞粘附移行方面，已有大量研究證實(shí)FAK與細(xì)胞的移行有重要的關(guān)系，而且細(xì)胞的移行依賴(lài)于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)-整合素-FAK這一系

6、列因素的相互作用。(3)在抑制凋亡方面，F(xiàn)AK家族對(duì)細(xì)胞有不同的影響。抑制FAK能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，這可能與PI3-K/Akt-1和MEK/Erk信號(hào)通路相關(guān)?？偠灾捎贔AK位于多條信號(hào)通路的上游，其對(duì)細(xì)胞生物行為的各個(gè)方面都起到一定的調(diào)節(jié)作用。
　　 目的：
　　 通過(guò)過(guò)氧化氫處理晶狀體上皮細(xì)胞，制造氧化應(yīng)激模型，研究氧化應(yīng)激晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、移行、凋亡、及形態(tài)學(xué)的改變，同時(shí)，觀察細(xì)胞內(nèi)黏著斑激酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)及活

7、化程度，初步探討?zhàn)ぶ呒っ甘欠駥?duì)氧化應(yīng)激晶狀體上皮細(xì)胞的調(diào)控功能。
　　 方法:
　　 1、晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)與處理:人品狀體上皮細(xì)胞(HLECs)細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞用含有10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％的CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合后，用不含血清、H2O2含量分別為0，30，50，70，100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DM

8、EM細(xì)胞0，30min，3h，6h，12h，24h。
　　 2、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率:將細(xì)胞密度調(diào)至1×108/L，并將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，置37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，24h細(xì)胞貼壁后棄上清，對(duì)照組（H2O2濃度為0μmol/L）加100μL低糖DMEM培養(yǎng)液，處理組分別加入H2O2濃度為30，50，70，100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM100μL，每

9、組設(shè)六個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育30min，3h，6h，12h，24h。避光取出，棄上清，PBS洗滌兩次，每孔加入100μL培養(yǎng)基和10μL CCK-8，再加入一組空白對(duì)照組（為無(wú)細(xì)胞組，僅加入培養(yǎng)基與CCK-8）至于培養(yǎng)箱內(nèi)2h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，波長(zhǎng)為450nm，測(cè)每孔吸光度A值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的生存率。生存率(％)=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100％。
　　 3、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞移行能力:將進(jìn)入

10、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的檢測(cè)細(xì)胞用100μL無(wú)菌槍頭在每個(gè)孔中長(zhǎng)滿的單層細(xì)胞上迅速而輕輕地劃1～2道痕，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍以去除掉脫落的細(xì)胞及培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子。對(duì)照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，處理組分別加入H2O2濃度為100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，測(cè)量8個(gè)值，分別于0時(shí)，12h，24h拍照觀察，通過(guò)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞爬行的距離，比較不同細(xì)胞劃痕修復(fù)速度。
　　 4、流式細(xì)胞儀

11、檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLECs，接種于6孔板，長(zhǎng)至90％融合后棄上清，移液管吸凈培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS液洗細(xì)胞3次。對(duì)照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，處理組分別加入H2O2濃度為100μmol/L、1000mol/L的低糖DMEM處理24h。按照美國(guó)eBioscience公司Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 5、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)黏著斑激酶的表達(dá)與分布:細(xì)胞爬片后，

12、對(duì)照組加入1000μL低糖DMEM培養(yǎng)液，處理組分別加入H2O2濃度為100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM1000μL置37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。棄去上清，PBS清洗三次，4％多聚甲醛室溫固定5min，PBS清洗三次，-80℃甲醇-20℃固定15min，PBS清洗三次。山羊血清封閉1h，PBS清洗后加入1∶200兔抗人FAK一抗4℃濕盒中孵育過(guò)夜。PBS清洗3次后，Hoechst3325

13、8染核1小時(shí)，F(xiàn)ITC熒光二抗孵育30min后，PBS清洗多余二抗，甘油封片。避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 6、western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FAK和磷酸化FAK的動(dòng)態(tài)表達(dá):細(xì)胞接種于6孔板上，長(zhǎng)至90％融合，棄上清。PBS清洗后，對(duì)照組加1000μL低糖DMEM培養(yǎng)液，處理組（實(shí)驗(yàn)組）分別加入H2O2濃度為100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM1000μL，二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30m

14、in，3h，6h，12h，24h。分別收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，取15μl蛋白上樣于8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳;轉(zhuǎn)移樣品蛋白于PVDF膜上;3％BSA室溫封閉1h，1∶1000FAK一抗4℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜3次，加1∶5000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h; TBST洗膜3次后，浸入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，暗室X線片壓片曝光，洗片。圖片經(jīng)光密度圖像掃描儀掃描，F(xiàn)lour Chem程序測(cè)定條帶光密度值。
　　 7統(tǒng)計(jì)處理采用S

15、PSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。變量采用（(x)±s）描述。通過(guò)One-way ANOVA法分析比較CCK-8各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中不同濃度組間的細(xì)胞存活率的差異，比較細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中不同濃度組中細(xì)胞的移行速度的差異，比較流式細(xì)胞結(jié)果中不同濃度處理組間細(xì)胞凋亡、死亡、存活率的差異，比較western blot實(shí)驗(yàn)中不同濃度組間FAK表達(dá)量的差異，LSD法（方差齊）或Dunnelt's T3法（方差不齊）對(duì)組間進(jìn)行兩兩比較。采用Two-wa

16、y ANOVA分析不同濃度過(guò)氧化氫和不同處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞移行速度是否存在交互效應(yīng)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、高濃度過(guò)氧化氫處理晶狀體細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變:貼壁細(xì)胞變得稀疏，細(xì)胞皺縮、輪廓增強(qiáng)、邊緣僵硬，并由原來(lái)的多邊形變成細(xì)長(zhǎng)型，形成偽足，細(xì)胞核與細(xì)胞漿界限不明顯。而FAK分布也集中至細(xì)胞拉長(zhǎng)部位。
　　 2、處理12小時(shí)以內(nèi)，500μmol/L濃度以上的過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞有殺傷

17、作用;處理24h時(shí)，不同濃度處理組間細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義F=17.96，p＜0.01。30，70，100，300μmol/L組的細(xì)胞較對(duì)照組增殖明顯，其存活率分別達(dá)到1.24±0.03％(p＜0.01)，1.35±0.08％(p＜0.01)，1.75±0.19％(p＜0.01)與1.37±0.17％(p=0.04)，但100μmol/L組與50，70，300μmol/L之間沒(méi)有明顯差異(p50=0.20，P70=0.051，p30

18、0=0.10)。而500，700，1000μmol/L組細(xì)胞存活率較之對(duì)照組降低(p500＜0.01,P700＜0.01,p1000＜0.010)。
　　 3、在無(wú)血清情況下培養(yǎng)細(xì)胞24h，100μmol/L組細(xì)胞移行速度最快，達(dá)到62.23±1.99單位/小時(shí)(p＜0.01)，對(duì)前、后12個(gè)小時(shí)移行速度進(jìn)行兩組間比較(two-way ANOVA)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移行速度除受到H2O2濃度影響外(F=23.34，p＜0.01)，還受到

19、時(shí)間因素的影響(F=27.76，p＜0.01)。此外，時(shí)間與濃度之間還存在交互效應(yīng)(F=9.61，p＜0.01)。
　　 4、細(xì)胞凋亡率總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.49，p=0.02)。對(duì)組間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，100μmol/L濃度處理組細(xì)胞總體凋亡率為2.40±0.01％，低于對(duì)照組的5.04±0.00％(p=0.01)及1000μmol/L濃度組的4.61±0.01％(p=0.02)比。而1000μmol/L濃度組細(xì)胞的凋

20、亡程度與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、0，100，300，500，700及1000μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞中FAK含量發(fā)生改變。其中，100，300μmol/L濃度組處理24小時(shí)后，F(xiàn)AK表達(dá)量增加，而700，1000濃度處理過(guò)后FAK表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在此過(guò)程中，F(xiàn)AK磷酸化被激活，隨處理濃度和處理時(shí)間的改變而改變。
　　 結(jié)論：
　　 過(guò)氧化氫對(duì)晶狀體上