黃芩苷通過A2aR途徑抑制小鼠肺間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、目的:
　　1.研究腺苷A2a受體(Adenosine A2a receptor，A2aR)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)通路與博來霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化的關(guān)系。
　　2.研究黃芩苷(baicalin

2、)對小鼠肺間質(zhì)纖維化的調(diào)控作用及其機制。
　　方法:
　　將24只雄性A2aR基因敲除小鼠隨機分為3組，每組8只，分別為A2aR敲除正常對照組(AN)，A2aR敲除BLM造模組(AM)，A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)，再將24只雄性野生小鼠也隨機分為3組，每組8只，分別為野生正常對照組(WN)，野生BLM造模組(WM)，野生BLM+黃芩苷組(WB)。通過向野生BLM造模組(WM)、野生BLM+黃芩苷組(WB)、A2aR

3、敲除BLM造模組(AM)、A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)小鼠氣管注射博來霉素來誘導(dǎo)肺纖維化，并對野生BLM+黃芩苷組(WB)、A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB）小鼠每天腹腔注射黃芩苷，造模28天。將組織切片進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE staining）和馬松染色(Masson staining)，在光鏡下進行肺間質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)改變以及膠原纖維增生情況的觀察，用透射電子顯微鏡觀察肺

4、組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，測定肺系數(shù)(肺濕重(mg)/體重(g))反應(yīng)肺損傷嚴(yán)重程度，檢測肺羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)顯示肺組織膠原纖維的具體含量，用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)測定血中的TGF-β1濃度，免疫組化法測定TGF-β1、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phosphorylation-ERK1/2，p-ERK1/2)和A2aR蛋白的在肺組

5、織中的含量及分布情況，蛋白印跡法(Western blot)測定TGF-β1、磷酸化ERK1/2(phosphorylation-ERK1/2，p-ERK1/2)和A2aR蛋白在肺中表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.肺系數(shù)測定，結(jié)果顯示野生BLM造模組（WM）和A2aR敲除BLM造模組(AM)分別較野生正常對照組(WN)和A2aR敲除正常對照組(AN)明顯升高（P均＜0.01）;而野生BLM+黃芩苷組(WB)和A2aR敲除

6、BLM+黃芩苷組(AB)分別較野生BLM造模組（WM）和A2aR敲除BLM造模組(AM)顯著降低（P值分別＜0.01和＜0.05）;而且，同一處理條件下，A2aR敲除組肺系數(shù)均高于野生組(正常組P＜0.01，造模組P＜0.05，黃芩苷組P＜0.01)。
　　2.羥脯氨酸含量檢測，結(jié)果顯示野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM)分別較野生正常對照組(WN)和A2aR敲除正常對照組(AN)明顯增多(P均＜0.01);

7、而野生BLM+黃芩苷組(WB)和A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)分別較野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM)顯著減少（P均＜0.05）;A2aR敲除BLM造模組(AM)和A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)分別較野生BLM造模組(WM)和野生BLM+黃芩苷組(WB)顯著升高（P均＜0.05）。
　　3.HE和Masson觀察肺組織病理學(xué)改變，野生正常對照組(WN)未見異常病理改變，A2aR敲除正常對照組(A

8、N)顯示肺泡間隔輕度增厚及少量的膠原纖維沉積。造模組有大量膠原纖維沉積，其中A2aR敲除BLM造模組(AM)纖維化程度最嚴(yán)重，黃芩苷可減輕肺纖維化，且野生組較A2aR敲除組病變較輕。
　　4.透射電鏡觀察肺超微結(jié)構(gòu)變化，野生正常對照組(WN)超微結(jié)構(gòu)無明顯變化，A2aR敲除正常對照組(AN)有輕度核固縮，野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM)均有明顯細(xì)胞破壞，空泡化，細(xì)胞間隙有大量膠原纖維沉積，但A2aR敲除B

9、LM造模組(AM)組肺泡間隔含更多膠原纖維，野生BLM+黃芩苷組(WB)和A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)超微結(jié)構(gòu)均有改善，且野生組較A2aR敲除組病變較輕。
　　5.ELISA、免疫組化、Western blot檢測血清及肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)，ELISA結(jié)果顯示野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組（AM)血清中TGF-β1表達(dá)明顯增加（P均＜0.01）;野生BLM+黃芩苷組（WB）和A2aR敲除BLM+

10、黃芩苷組(AB)分別較野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM)顯著下降(P均＜0.01);同一處理條件下，A2aR敲除組均高于野生組（P均＜0.05）。肺組織免疫組化學(xué)及Western blot檢測結(jié)果與ELISA結(jié)果一致。
　　6.免疫組化、Western blot檢測肺組織中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)，Western blot肺組織勻漿ERK1/2蛋白各組表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);p-ERK

11、1/2蛋白野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM）表達(dá)明顯增加（P均＜0.01）;野生BLM+黃芩苷組(WB)和A2aR敲除BLM+黃芩苷組(AB)分別較野生BLM造模組(WM)和A2aR敲除BLM造模組(AM)顯著降低（P值分別＜0.05和＜0.01）;同一處理條件下，A2aR敲除組均高于野生組（P均＜0.05）。p-ERK1/2與ERK1/2比值與p-ERK1/2的表達(dá)趨勢一致。肺組織p-ERK1/2免疫組化檢測結(jié)

12、果與Westernblot結(jié)果一致。
　　7.免疫組化、Western blot檢測野生型小鼠肺組織中A2aR蛋白表達(dá)，Western blot肺組織勻漿A2aR蛋白野生BLM造模組(WM)較野生正常對照組(WN)表達(dá)增加(P＜0.01);而且野生BLM+黃芩苷組(WB)較野生BLM造模組(WM)顯著升高(P＜0.05)。免疫組化檢測結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.A2aR可能通過TGF-