EB病毒感染調(diào)控長鏈非編碼RNA H19參與胃癌發(fā)生發(fā)展的研究.pdf

1、目的：①篩選胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS穩(wěn)定感染EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)后差異表達(dá)的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，為探討EBV的致瘤機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。②明確EBV陽性和陰性胃癌細(xì)胞系以及組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平及差異；探討EBV感染對(duì)胃癌組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、H19印記狀態(tài)的影響。
　　方法：①采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)對(duì)

2、 AGS細(xì)胞系和穩(wěn)定感染 EBV的AGS-EBV細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。②對(duì)獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括lncRNAs表達(dá)水平分析、差異表達(dá) lncRNAs的靶基因預(yù)測，以及預(yù)測靶基因的GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。③采用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測EBV陽性胃癌細(xì)胞系(GT-38、GT-39、SNU719、AGS

3、-EBV)、EBV陰性胃癌細(xì)胞系(MKN-45、SGC7901、HGC-27、AGS)、EBVaGC及EBVnGC組織中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平。④亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfate genomic sequencing，BGS)及sequenom MassArray飛行質(zhì)譜法檢測EBV陽性及陰性胃癌細(xì)胞系、EBVaGC及EBVnGC組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)；結(jié)合檢測區(qū)434G/T多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)434G/T

4、雜合型標(biāo)本進(jìn)行H19啟動(dòng)子區(qū)等位基因特異性甲基化分析。⑤依據(jù)H19第5外顯子區(qū)有單一的RsaⅠ多態(tài)性酶切位點(diǎn)，采用限制性片段長度多態(tài)性(restrictive fragment length polymorphisms，RFLP)結(jié)合PCR技術(shù)（RFLP-PCR)檢測EBVaGC和EBVnGC組織中H19基因的印記狀態(tài)。
　　結(jié)果：①與AGS細(xì)胞系相比，AGS-EBV細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)879條差異表達(dá)的lncRNAs，包括47條表達(dá)上調(diào)

5、，832條表達(dá)下調(diào)；其中24條lncRNAs在AGS中不表達(dá)，243條lncRNAs在AGS-EBV中不表達(dá)。差異表達(dá)的lncRNAs中有腫瘤相關(guān)性lncRNAs，如H19和CCAT1已經(jīng)證明與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。②部分差異表達(dá)的lncRNAs預(yù)測到靶基因，通過 GO富集分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測的靶基因參與了多種生物學(xué)過程(biological_process)、細(xì)胞成分的組成(cellular_component)及分子功能(molecular_

6、function)。有些lncRNA的靶基因與凋亡過程(apoptotic process)、細(xì)胞周期阻滯(cell cycle arrest)及細(xì)胞增殖(cell proliferation)等密切相關(guān)。靶基因的KEGG分析結(jié)果顯示，這些靶基因主要參與氧化磷酸化、代謝途徑、內(nèi)吞作用、唾液腺分泌、胰腺分泌及某些代謝性疾病如Alzheimer癥、Huntington病和Parkinson病等途徑。③4種EBV陽性細(xì)胞系lncRNA H19

7、平均表達(dá)水平明顯低于4種EBV陰性細(xì)胞系(0.04789±0.02991vs4.061±0.4192，P<0.001)；EBVaGC組織中l(wèi)ncRNA H19的平均表達(dá)水平明顯低于EBVnGC(0.7024±0.4000vs3.646±0.7058，P<0.001)。④EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子均呈高甲基化狀態(tài)，而EBV陰性細(xì)胞系僅個(gè)別CpG位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài)，EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子CpG甲基化率明顯高于EBV陰性組。BGS法及質(zhì)

8、譜法檢測結(jié)果顯示21例EGVaGC及17例EBVnGC組織標(biāo)本中H19啟動(dòng)子平均甲基化率均接近50％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.7791，P=0.729)；兩組間高甲基化及低甲基化標(biāo)本組成也無顯著性差異(P=0.721)。對(duì) EBVaGC及 EBVnGC組織中434G/T雜合性標(biāo)本(各5例)進(jìn)行了等位基因差異性甲基化分析，結(jié)果顯示EBVaGC組織中，一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài)，另一條等位基因亦出現(xiàn)了不同程度的甲基化，其中PL4

9、55兩條等位基因均幾乎完全甲基化；EBVnGC組標(biāo)本一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài)，另一條等位基因保持幾乎完全未甲基化狀態(tài)，但Q589兩條等位基因均幾乎完全未甲基化，EBVaGC組H19啟動(dòng)子甲基化程度高于EBVnGC組。⑤自39例EBVaGC及86例EBVnGC標(biāo)本中分別篩選出H19第5外顯子區(qū)RsaⅠ多態(tài)性酶切位點(diǎn)雜合型標(biāo)本24例及28例；有6例EBVaGC組織中(25%，6/24) H19呈雙等位基因表達(dá)，EBVnGC中亦有

10、6例(21.43%，6/28) H19呈雙等位基因表達(dá)，兩組間H19印記丟失率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.00)。
　　結(jié)論：①EBV穩(wěn)定感染AGS細(xì)胞系可導(dǎo)致宿主細(xì)胞lncRNAs表達(dá)水平發(fā)生改變，以表達(dá)下調(diào)的lncRNAs居多。部分差異表達(dá)的lncRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。②差異表達(dá)的lncRNAs參與了多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)，提示EBV可以通過lncRNA進(jìn)一步作用于其靶基因，進(jìn)而更廣泛地影響宿主基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與EBV相關(guān)腫瘤的

11、發(fā)生發(fā)展。③EBV感染對(duì)胃癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)具有顯著影響，EBV可能通過調(diào)控lncRNA H19的表達(dá)參與EBVaGC的發(fā)生與發(fā)展。④EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯高于 EBV陰性細(xì)胞系，啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與 lncRNA H19的表達(dá)水平密切相關(guān)，是調(diào)控H19表達(dá)的重要因素。但EBVaGC和EBVnGC組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度無顯著性差異，提示體內(nèi)除啟動(dòng)子甲基化外，尚有其它因素參與H19轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)