MSC及Poly(I-C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用及機制.pdf

1、膿毒癥是臨床ICU中常見的危重病癥，其發(fā)生率和死亡率均很高。膿毒癥早期即存在腸屏障功能障礙，它受損可直接導(dǎo)致腸通透性增加，細菌入血，從而加重膿毒癥，這也是啟動多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至導(dǎo)致機體死亡的重要因素。因此，保護膿毒癥腸屏障功能顯得非常重要。
　　間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一類多能干細胞，具有多向分

2、化潛能，也可通過旁分泌多種營養(yǎng)趨化因子參與損傷組織的修復(fù)。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSC可治療膿毒癥，對膿毒癥肝、心、腎、肺等器官都有保護作用。此外，在炎癥性腸病、放射性腸損傷、缺血再灌注腸損傷等腸道疾病中，MSC也發(fā)揮了較好的腸屏障保護功能，但目前尚未見到MSC對膿毒癥腸屏障功能保護及相關(guān)機制的報道。
　　大量文獻及臨床研究實驗發(fā)現(xiàn)，由于MSC仍有一定免疫原性，導(dǎo)致異體移植的MSC在機體存活時間短、存活數(shù)量有限，這限制了MSC的臨床應(yīng)用。

3、聚肌苷酸胞苷酸Poly(I∶C)是雙鏈RNA類似物，Toll樣3受體激動劑。有研究發(fā)現(xiàn)，Poly(I∶C)不僅可增強MSC的遷移及免疫調(diào)節(jié)功能，降低MSC免疫原性，也可增強MSC旁分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factors，TGF-β）、成纖維細胞生長因子(Fibroblastgrowth factor，F(xiàn)GF)等多種生長因子的作用，從而增強MSC對肝、心等重要臟器的保護功能，但Poly(I∶C)預(yù)刺激

4、是否可增強MSC對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用，未見相關(guān)報道。
　　目的:
　　本實驗采用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，研究MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用及機制。具體內(nèi)容包含兩部分:(1) MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用;(2) MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能

5、的保護機制。
　　方法:
　　提取SD大鼠間充質(zhì)干細胞并培養(yǎng)，取第3-5代用于后續(xù)治療膿毒癥大鼠及其他實驗。觀察處理后大鼠腸通透性、血D-Lac濃度、內(nèi)毒素濃度;常規(guī)觀察小腸病理形態(tài)學(xué)改變，并采用免疫組化觀察腸緊密連接蛋白ZO-1表達;離體腸上皮細胞水平觀察單層跨上皮電阻TER及緊密連接蛋白ZO-1表達;熒光標記MSC觀察MSC在小腸黏膜分布情況，Elisa測定MSC旁分泌生長因子變化;MTT測定IEC-6增殖情況。

6、　　結(jié)果:
　　第一部分 MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用
　　1、整體動物上，膿毒癥大鼠腸屏障功能受損明顯，表現(xiàn)為腸道對EB通透率明顯增加，血D-Lac、內(nèi)毒素濃度升高，腸組織緊密連接蛋白ZO-1表達降低，腸病理結(jié)構(gòu)顯示腸粘膜充血水腫，腸絨毛斷裂，炎細胞、紅細胞滲出明顯;予以常規(guī)治療后，膿毒癥大鼠腸屏障功能得到一定的改善，腸病理顯示紅細胞滲出減少，炎癥減輕，ZO-1表達上調(diào)，72h存活率有

7、所上升; MSC聯(lián)合常規(guī)治療后，可明顯改善膿毒癥大鼠腸通透性，降低血中D-Lac及內(nèi)毒素濃度，并改善膿毒癥大鼠腸病理結(jié)構(gòu)，起到對腸組織較好的修復(fù)作用，72h存活率明顯增加，為37.5％; Poly(I∶C)預(yù)刺激MSC可增強MSC對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用，主要表現(xiàn)在小腸對EB的通過率進一步減少，血中D-Lac及內(nèi)毒素濃度顯著降低，腸病理結(jié)構(gòu)明顯得到恢復(fù)，腸絨毛數(shù)量增加、紅細胞滲出明顯減少及緊密連接蛋白表達顯著上升，72h存活率升

8、至50％。
　　2、離體腸上皮細胞水平上，LPS刺激后的IEC-6通透性（TER表示）顯著降低，緊密連接蛋白ZO-1紊亂斷裂表達下降明顯;經(jīng)MSC處理后，IEC-6通透性有所回升，緊密連接蛋白ZO-1表達開始規(guī)則連續(xù);Poly(I∶C)預(yù)刺激的MSC進一步改善了IEC-6的通透性，使ZO-1較為規(guī)則連續(xù)，表達明顯增高。
　　上述結(jié)果說明:MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能具有明顯的保護作用，且Poly(

9、I∶C)可增強MSC對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用。
　　第二部分 MSC及Poly(I∶C)預(yù)刺激后對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用機制
　　1、直接機制--MSC直接在腸粘膜定植參與受損腸組織修復(fù)
　?、?、整體動物水平上，通過腺病毒轉(zhuǎn)染GFP標記MSC，發(fā)現(xiàn)MSC可在膿毒癥大鼠腸粘膜定植參與修復(fù);經(jīng)Poly(I∶C)預(yù)刺激后，有更多的MSC在腸粘膜定植。
　　2、間接機制—MSC旁分泌生長因子參與受損腸組織

10、修復(fù)
　?、?、MSC旁分泌生長因子變化
　　通過對整體及離體水平上MSC旁分泌生長因子的檢測，發(fā)現(xiàn)整體動物血中及MSC培養(yǎng)基上清液中，F(xiàn)GF、TGF-β、SDF-1α水平顯著增加;經(jīng)Poly(I∶C)預(yù)刺激后，MSC對TGF-β、SDF-1α、FGF的旁分泌功能顯著增強。
　?、凇SC上清液可保護經(jīng)LPS刺激后的IEC-6，改善腸上皮通透性。
　　在離體水平上，分離MSC上清液，加入上清液后可改善LPS刺激后的

11、IEC-6通透性，表現(xiàn)為TER值的上升及緊密連接蛋白ZO-1表達增加。測定IEC-6增殖情況，發(fā)現(xiàn)MSC上清液促進IEC-6增殖，而Poly(I∶C)可增強MSC對IEC-6的保護作用。
　　結(jié)論:
　　1、MSC可保護膿毒癥腸屏障功能，具體表現(xiàn)為MSC改善了膿毒癥腸通透性（腸對EB透過率），降低血中D-Lac及內(nèi)毒素濃度，并可修復(fù)受損腸組織，上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1。
　　2、Poly(I∶C)預(yù)刺激能增強MSC對膿

12、毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用，表現(xiàn)為進一步改善腸通透性，降低血D-Lac及內(nèi)毒素濃度，顯著增強MSC對受損腸組織的修復(fù)。
　　3、MSC發(fā)揮保護膿毒癥腸屏障功能的主要機制有直接機制和間接機制。直接機制是MSC可通過在膿毒癥大鼠受損腸黏膜定植參與修復(fù)，Poly(I∶C)預(yù)刺激可增加MSC的定植數(shù)量;間接機制主要是MSC通過旁分泌生長因子TGF-β、FGF、SDF-1α上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1表達并促進腸上皮的增殖從而發(fā)揮保護膿毒癥腸