AhR活化對腸粘膜屏障功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:腸粘膜屏障（Intestinal epithelial barrier, IEB）是腸道重要的結(jié)構(gòu)和功能屏障。IEB不僅能參與腸道結(jié)構(gòu)維系，也能通過調(diào)控腸道物質(zhì)的消化吸收，提供機(jī)體生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。同時，IEB抵御和清除致病菌，并維系機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但各種急慢性病理條件的刺激，均可能引起IEB功能障礙，繼發(fā)腸道功能紊亂，甚至導(dǎo)致腸源性感染和全身性炎癥反應(yīng)。
　　腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial ce

2、lls，IECs)是腸粘膜屏障最主要的結(jié)構(gòu)組成。在連續(xù)相鄰的細(xì)胞膜之間，緊密連接和緊密連接相關(guān)蛋白，比如膜蛋白claudins，occludins以及胞質(zhì)斑蛋白zonula occludens(ZO)，共同構(gòu)成一個具有選擇性通透性的復(fù)合體。它不僅是腸粘膜的重要組成部分，也是調(diào)控腸粘膜細(xì)胞旁通路的關(guān)鍵元件。近來發(fā)現(xiàn)，缺氧或LPS刺激下，肌球蛋白輕鏈(MLC)受到肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的激活而發(fā)生磷酸化，誘發(fā)腸粘膜緊密連接蛋白ZO-1

3、的結(jié)構(gòu)和功能破壞，引起腸粘膜屏障通透性的增加。因此，MLCK-pMLC磷酸化通路在介導(dǎo)腸粘膜屏障的破壞中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制就是緊密連接的破壞。
　　芳香烴受體(Aryl Hydrocarybon Receptor，AhR)，一種需要與配體配對并激活的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個組織和細(xì)胞。與配體結(jié)合以后，活化的AhR由胞漿轉(zhuǎn)移入核，隨后與AhR核轉(zhuǎn)位子(AhR Nuclear Translocator, ARNT)形成異源二

4、聚體，調(diào)控目的基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性配體比如吲哚并[3，2-B]咔唑-6-甲醛(6-formylindolo(3，2-b) carbazole，F(xiàn)ICZ)能夠活化AhR，參與細(xì)胞生理功能的維持，如細(xì)胞的增值、凋亡以及免疫反應(yīng)等。
　　越來越多的證據(jù)表明，AhR在調(diào)節(jié)腸粘膜屏障功能上發(fā)揮著重要作用。其中，大部分都是研究AhR在腸道免疫細(xì)胞中的作用，比如在腸道固有單核細(xì)胞(Lamina propriamononuclear cel

5、ls，LPMCs)中上調(diào)IL-22來抑制免疫反應(yīng)等。而事實上，AhR在腸上皮細(xì)胞中也大量表達(dá)，并且腸上皮細(xì)胞有更多的機(jī)會與AhR從食物來源以及菌群共生產(chǎn)生的內(nèi)源性配體接觸。
　　本課題擬在模擬體內(nèi)腸梗阻模型以及體外缺氧模型，通過跨膜電阻檢測、蛋白質(zhì)免疫印跡、realtime-PCR、免疫熒光等技術(shù)，探討腸梗阻缺血缺氧條件下AhR的活化是如何參與調(diào)控腸屏障功能，并探討其中作用機(jī)制，為患者腸粘膜功能的保護(hù)提供新思路。
　　方法:

6、1、建立小鼠腸梗阻模型，應(yīng)用HE染色、組織學(xué)評分、Ussing Chamer技術(shù)，觀察腸粘膜損傷情況。
　　2、通過免疫熒光、realtime-PCR技術(shù)，觀察AhR分布表達(dá)以及活性的變化。
　　3、利用免疫熒光、realtime-PCR技術(shù)，觀察腸梗阻模型中緊密連接蛋白ZO-1分布與表達(dá)的變化。
　　4、利用免疫熒光、realtime-PCR技術(shù)，觀察腸梗阻模型中MLCK、pMLC分布與表達(dá)的變化。
　　5、構(gòu)

7、建體外Caco-2缺氧模型，通過蛋白質(zhì)免疫印跡、realtime-PCR技術(shù)、TER檢測，進(jìn)一步觀察缺氧條件下，F(xiàn)ICZ活化AhR后，腸細(xì)胞屏障損傷情況以及MLCK-pMLC通路的影響。
　　6、通過干擾AhR，通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，觀察缺氧條件下AhR缺陷對MLCK-pMLC通路的影響。
　　結(jié)果:1、小鼠腸梗阻模型中，腸粘膜正常形態(tài)學(xué)改變，絨毛斷裂、水腫，上皮細(xì)胞脫落，chiu氏組織評分增加，粘膜通透性增加。而加入Ah

8、R激動劑FICZ后，腸粘膜損傷緩解。
　　2、小鼠腸梗阻模型中，緊密連接蛋白ZO-1連續(xù)性斷裂，表達(dá)減弱。而加入FICZ后，ZO-1連續(xù)性有所恢復(fù)。
　　3、小鼠腸梗阻模型中，MLCK、pMLC表達(dá)明顯增強(qiáng)。而FICZ后，抑制了兩者表達(dá)。
　　4、體外Caco-2缺氧模型中，AhR的活化抑制了MLCK和pMLC蛋白水平表達(dá)，同時維持了ZO-1的表達(dá)分布。通透性實驗顯示腸細(xì)胞屏障得到恢復(fù)。
　　5、體外Caco-2