PNPLA3基因I148M多態(tài)性在體外培養(yǎng)肝細胞中的作用研究.pdf

1、目的:探討PNPLA3基因I148M多態(tài)性在體外培養(yǎng)肝細胞中的作用機制。
　　 方法:對經(jīng)典的兩步灌流法進行簡化，經(jīng)下腔靜脈灌流，脈沖式灌注;對肝細胞分離液進行低速離心純化;預先用鼠尾膠原鋪備培養(yǎng)瓶;臺盤藍染色鑒定細胞存活率;倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。PCR技術得到PNPLA3基因野生型和I148M突變型的完整編碼序列，將序列克隆到載體質粒pEGH中，構建載體質粒pEGH-PNPLA3和pEGH-PNPLA3 I148M;載體質粒

2、pEGH-PNPLA3或pEGH-PNPLA3 I148M與慢病毒包裝質粒pRsv-REV、pMD(l)g-pRR和pMD2G共轉染293T細胞，得到攜帶PNPLA3基因野生型和I148M突變型完整編碼序列的慢病毒;兩種慢病毒各自感染Huh-7細胞;Western blot檢測Huh-7細胞中PNPLA3蛋白野生型和突變型的過表達情況。穩(wěn)定過表達目的基因的細胞長至90％融合度時，消化裂解細胞，全自動生化分析儀檢測細胞裂解液內脂質代謝相關

3、產(chǎn)物。穩(wěn)定過表達目的基因的細胞長至70％融合度時，加入終濃度為50μmol/L的辛伐他汀，24小時后，消化裂解細胞，全自動生化分析儀檢測細胞裂解液內脂質水平。穩(wěn)定過表達目的基因的細胞長至90％融合度時，消化細胞，流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 結果:改進后的分離方法得到了足夠數(shù)量的肝細胞;臺盤藍染色示細胞活率大于90％;細胞形態(tài)與活力可穩(wěn)定保持1周。成功構建慢病毒載體;熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒有效感染Huh-7，經(jīng)過篩選，細胞感

4、染有效率超過95％; Western blot證實PNPLA3蛋白野生型和突變型成功過表達。與空病毒組相比，過表達PNPLA3基因的細胞內甘油三酯、總膽固醇、脂蛋白含量明顯升高，轉氨酶水平也明顯升高，過表達PNPLA3基因I148M突變型的細胞內以上指標升高更明顯。經(jīng)過辛伐他汀處理24小時以后，空病毒組與過表達PNPLA3基因野生型的Huh-7細胞內的甘油三酯和總膽固醇的含量有顯著下降，而過表達PNPLA3基因I148M突變型的Huh-

5、7細胞內的甘油三酯和總膽固醇含量不降反升。在Huh-7細胞內過表達PNPLA3基因I148M突變型，改變了細胞的有絲分裂過程，使得異倍體（S期）和4倍體（G2/M期）增多，而二倍體（G0/G1期）減少。
　　 結論:成功建立了一種簡單的小鼠原代肝細胞的分離與培養(yǎng)方法。成功構建了PNPLA3基因慢病毒載體及Huh-7過表達PNPLA3細胞系。成功證實了PNPLA3基因I148M多態(tài)性可以獨立引起體外培養(yǎng)肝細胞脂肪變性，降低體外培養(yǎng)