應(yīng)用兩種生物模式探討抗VEGF單克隆抗體BD0801的抗血管生成作用.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用兩種生物模式探討人源化抗VEGF單克隆抗體BD0801單藥或聯(lián)合細(xì)胞毒藥物的抗血管生成作用，并初步探討其機(jī)制。
　　方法:
　　1、BD0801單藥實(shí)驗(yàn):
　　斑馬魚實(shí)驗(yàn):采用24hpf(hours post fertilization，hpf,受精后小時(shí))健康血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，脫去外膜后隨機(jī)分組:BD0801低濃度組，BD0801中濃度組，BD0801高濃度組;貝伐珠單抗(B

2、ev)低濃度組，Bev中濃度組，Bev高濃度組;魚水對(duì)照組（陰性對(duì)照組）。加入藥物與胚胎共同孵育48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察背部節(jié)間血管(intersegmental vessels，ISV)生成數(shù)目，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組胚胎VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　雞胚尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn):采用九日齡雞胚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為七組:BD0801低濃度組，BD0801中濃度組，BD0801高濃度組;貝伐珠單抗(Bev)低濃度

3、組，Bev中濃度組，Bev高濃度組;生理鹽水對(duì)照組（陰性對(duì)照組）。暴露CAM后植入甲基纖維素碟，加入各組藥物，72小時(shí)后觀察血管生長情況，計(jì)算緊鄰甲基纖維素碟旁一個(gè)視野內(nèi)的血管數(shù)目，并進(jìn)行比較。
　　2、BD0801聯(lián)合細(xì)胞毒藥物實(shí)驗(yàn):
　　斑馬魚實(shí)驗(yàn):在單藥實(shí)驗(yàn)取得陽性結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用24hpf健康血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，脫去外膜后隨機(jī)分組:BD0801單藥處理組和BD0801聯(lián)合OXA處理組、BD08

4、01聯(lián)合5-FU處理組;Bev單藥處理組（陽性對(duì)照組）和Bev聯(lián)合OXA處理組（陽性對(duì)照組）、Bev聯(lián)合5-FU處理組（陽性對(duì)照組）、OXA和5-FU單藥處理組（陽性對(duì)照組）、魚水對(duì)照組（陰性對(duì)照組）。加入藥物與胚胎共同孵育48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察背部節(jié)間血管(intersegmental vessels，ISV)生成數(shù)目，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組胚胎VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　雞胚尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn):采用

5、九日齡雞胚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為七組BD0801單藥處理組和BD0801聯(lián)合OXA處理組、BD0801聯(lián)合5-FU處理組;Bev單藥處理組（陽性對(duì)照組）和Bev聯(lián)合OXA處理組（陽性對(duì)照組）、Bev聯(lián)合5-FU處理組（陽性對(duì)照組）、OXA和5-FU單藥處理組（陽性對(duì)照組）。暴露CAM后植入甲基纖維素碟，加入各組藥物，72小時(shí)后觀察血管生長情況，計(jì)算緊鄰甲基纖維素碟旁一個(gè)視野內(nèi)的血管數(shù)目，并進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　BD08

6、01單藥實(shí)驗(yàn):
　　1、與陰性對(duì)照組相比，BD0801能夠有效抑制斑馬魚胚胎ISV生成(P＜0.05)，與陽性藥物Bev相比，BD0801抑制作用更強(qiáng)，抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:BD0801可以下調(diào)斑馬魚胚胎組織VEGF mRNA的水平(P＜0.05)，與陽性對(duì)照組相比，下調(diào)作用更強(qiáng)，且與藥物濃度呈正相關(guān)。
　　2、與陰性對(duì)照組相比，BD0801具有抑制CAM血管生長的作用(P＜0.05)，與陽性

7、藥物Bev相比，抑制作用更強(qiáng)，抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。
　　BD0801聯(lián)合細(xì)胞毒藥物實(shí)驗(yàn):
　　1、與陰性對(duì)照組相比，BD0801單藥、Bev單藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯(lián)合用藥組能夠有效抑制斑馬魚胚胎ISV生成(P＜0.05)，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組抑制作用更強(qiáng)(P＜0.05)。且與Bev聯(lián)合用藥相比，BD0801聯(lián)合用藥對(duì)血管抑制程度更強(qiáng)(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:BD0801單藥、Bev單

8、藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯(lián)合用藥組VEGF基因mRNA的表達(dá)被下調(diào)，聯(lián)合用藥組的下調(diào)程度強(qiáng)于單藥組，且與Bev聯(lián)合用藥組相比，BD0801聯(lián)合用藥組VEGF基因mRNA的表達(dá)量更低。
　　2、與陰性對(duì)照組相比，BD0801單藥、Bev單藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯(lián)合用藥組具有抑制CAM血管生長的作用(P＜0.05)，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組抑制作用更強(qiáng)(P＜0.05)。與Bev聯(lián)合用藥相比，BD0801聯(lián)合用藥抑制血

9、管的作用更強(qiáng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　BD0801能夠有效抑制斑馬魚及CAM模型的血管生成，且作用強(qiáng)于Bev，其作用機(jī)制可能與下調(diào)組織細(xì)胞VEGFmRNA的水平有關(guān);BD0801聯(lián)合5-FU/OXA可協(xié)同抑制斑馬魚及CAM模型血管生成，其作用機(jī)制可能與協(xié)同下調(diào)組織細(xì)胞VEGF mRNA的水平有關(guān)。本研究提示，BD0801單藥或聯(lián)合5-FU/OXA可能通過靶向VEGF而有效抑制斑馬魚及CAM模型血管生成，值得進(jìn)一步深