一種重組抗EGFR單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、EGFR(Epithelial growth factor receptor,表皮生長因子受體)是由原癌基因C-erbB-1(HER-1)編碼的分子量為170 KDa(Kilodalton,千道爾頓)的跨膜糖蛋白。EGFR本身具有酪氨酸激酶的活性,一旦與EGF(Epithelial growth factor,表皮生長因子)或者其它相關(guān)配體結(jié)合即可啟動細胞內(nèi)的信號傳導通路,刺激有關(guān)基因表達,從而促進細胞分裂增殖,因此EGFR在細胞生理過

2、程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。人們在許多上皮惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有EGFR的異常高表達,證實EGFR與癌細胞的快速增殖、新生血管的形成、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移,以及細胞凋亡的抑制等等有關(guān),因此提示EGFR有可能成為治療腫瘤疾病的潛在靶點??笶GFR單克隆抗體是能夠與EFGR特異性結(jié)合,通過競爭性抑制EFGR與其配體結(jié)合,從而達到抑制細胞增殖信號傳導的靶向性抗體。目前最早上市的抗EGFR單克隆抗體是2004年被美國FDA(the Food andDrug

3、 Administration)批準的西妥昔單抗(cetuximab,Erbitux(@)),是一種重組的抗EGFR人鼠嵌合單克隆抗體,用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。該產(chǎn)品已于2009年獲批進入中國市場銷售,中文商品名:愛必妥。Erbitux的生產(chǎn)制備使用了SP2/0小鼠骨髓瘤細胞表達系統(tǒng)。
  上??贵w藥物國家工程研究中心利用基因工程技術(shù)開發(fā)了一種重組抗EGFR人鼠嵌合單克隆抗體(Recombinant Chimeric Anti-E

4、GFR Monoclonal Antibody,以下簡稱Anti-EGFR)。該抗體是原研藥Erbitux的生物類似藥(Follow-On Biologics,F(xiàn)OB),所不同的是該抗體的生產(chǎn)制備采用了CHO(Chinese Hamster Ovary Cell,中國倉鼠卵巢細胞)細胞表達系統(tǒng)并使用了自有的抗體生產(chǎn)工藝技術(shù)。單克隆抗體(MonoclonalAntibody,mAb)是一類大分子糖蛋白,有研究表明,細胞表達系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)過

5、程以及細胞培養(yǎng)條件會影響蛋白質(zhì)的糖基化修飾,而蛋白質(zhì)糖基化又與某些蛋白質(zhì)功能相關(guān),因此,為了了解和比較兩種不同細胞表達系統(tǒng)所生產(chǎn)的重組抗EGFR單克隆抗體在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能方面存在哪些異同,以及受試藥Anti-EGFR是否可以成為抗腫瘤治療藥物的候選藥,本研究將以原研藥Erbitux作為參考對照,針對受試藥Anti-EGFR的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)進行表征分析和確證,并對其體內(nèi)外抗腫瘤功能進行了研究和評價。
  在抗體結(jié)構(gòu)表征分

6、析中,本研究分別從一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上對受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux的異同進行了全面和深入研究。首先,應用LC-ESI-Q-TOF技術(shù),從質(zhì)譜分子量、質(zhì)量肽圖、糖基化修飾逐步解析受試藥Anti-EGFR的一級結(jié)構(gòu)信息,并對差異進行重點解剖。我們研究發(fā)現(xiàn),受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux具有相同的氨基酸序列,但在糖基化上存在重大差異:原研藥Erbitux唾液酸化以NGNA型為主,含有較多galac

7、tose-a-1,3-galactose結(jié)構(gòu)寡糖修飾,高甘露糖水平是受試藥Anti-EGFR的6倍,存在較大的免疫原性風險;受試藥Anti-EGFR唾液酸化以NANA型為主,基本不含α1-3型半乳糖;由于我們采用了與人細胞更接近的CHO細胞表達系統(tǒng)從而規(guī)避或大大降低了原研藥Erbitux潛在的免疫原性高風險。其次,本研究還分析確證了兩種抗體的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)情況:受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux的熱熔變化趨勢基本一致(Tm值

8、基本一致),表明其折疊和穩(wěn)定性基本一致;通過CD遠紫外區(qū)和近紫外區(qū)掃描分析,顯示兩種單抗二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的高度類似性;而且通過分子內(nèi)部熒光分析,兩種抗體的芳香族氨基酸殘基的側(cè)鏈基團構(gòu)象基本一致,蛋白質(zhì)整體空間構(gòu)象沒有發(fā)生變化。
  兩種抗體的體外藥效學研究結(jié)果顯示,受試藥Anti-EGFR在抗原結(jié)合能力、細胞增殖抑制能力以及ADCC作用方面與原研藥Erbitux類似;受試藥Anti-EGFR抗體能夠顯著抑制EGFR及其下游信號通

9、路的磷酸化,并且對人表皮細胞癌A431(EGFR高表達的人腫瘤細胞株)具有較強的體外抗腫瘤生長抑制作用。
  兩種抗體的體內(nèi)藥效學研究結(jié)果顯示,受試藥Anti-EGFR對人表皮細胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用非常顯著,并且對受試藥Anti-EGFR處理后的腫瘤組織進行免疫組化的分析,進一步確證受試藥Anti-EGFR通過抑制腫瘤組織中EGFR磷酸化,抑制EGFR所參與調(diào)控的與細胞增殖密切相關(guān)的信號傳導通路,從而抑制腫瘤

10、細胞的增殖能力,發(fā)揮其抗腫瘤作用。
  本研究結(jié)果證實,受試藥Anti-EGFR設(shè)計與原研藥Erbitux相同的氨基酸序列和不同的細胞表達系統(tǒng),達到大大降低引起免疫原性風險的NGNA、galactose-a-1,3-galactose結(jié)構(gòu)、高甘露糖糖基化含量的設(shè)計目的,同時保證在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)方面高度類似,蛋白質(zhì)整體空間構(gòu)象沒有發(fā)生改變,確保所期望的功能和藥效,并且在隨后的體內(nèi)外藥學研究中證實,受試藥Anti-EGFR對

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