長白豬Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)的分子克隆和表達分析及GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬表型分析.pdf

1、本文通過以下幾個部分展開論述：
　　第一部分、長白豬Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)的分子克隆和表達分析
　　目的:Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)在胚胎發(fā)育，器官形成方面有重要作用，是Hedgehog(Hh)信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，也是非常保守的調(diào)控因子。Gli3基因突變，引起多種綜合征，以及器官畸形。作為大動物長白豬中的Gli3基因在Genbank中只有幾個外顯子，沒有完成的基因序列。本實驗旨在通過已知幾個外顯子，克隆

2、出全長的Gli3基因。
　　方法:(1)提取長白豬肺組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;(2)通過已知外顯子和基因同源性設(shè)計Gli3基因引物，克隆Gli3基因中后段序列，利用RACE技術(shù)克隆Gli3基因兩端序列，即可得到Gli3的全長序列;(3)生物信息學預測Gli3基因的開放閱讀框，Gli3蛋白的生化特征，N-糖基化，磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)，模擬三級空間結(jié)構(gòu)，生物進化樹;(4)實時定量PCR檢測Gli3基因在長白豬胎兒110天和成年

3、豬中的心、肝、脾、肺、腎、腦、皮、肌肉、舌等器官和組織中的基因相對表達水平。
　　結(jié)果:獲得長白豬Gli3基因全長序列6289個堿基，完整的閱讀框，其中包括從292到5052共4761堿基編碼序列，291個堿基為5'端非編碼區(qū)，1237個堿基為3'端末端非編碼區(qū)。長白豬Gli3基因共編碼1587個氨基酸。生物信息學分析蛋白分子量約為169kDa，等電點約為7.2，沒有預測到N端的信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，沒有O連接糖基化位點，有6個N連

4、接糖基化位點，預測到Gli3蛋白有大量磷酸化位點。Gli3蛋白有4個鋅指結(jié)構(gòu)的保守結(jié)構(gòu)。無規(guī)則卷曲在Gli3蛋白二級結(jié)構(gòu)中占主要地位。實時定量PCR檢測Gli3基因結(jié)果顯示在長白豬胎兒和成年長白豬的脾，肺，腎，腦均有高表達。
　　結(jié)論:通過RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆出長白豬Gli3基因全長序列。為長白豬中Gli3基因的研究提供了分子基礎(chǔ)。
　　第二部分、GIPR血轉(zhuǎn)基因豬表型分析
　　目的:通過克隆方法建立的G

5、IPR過表達顯性抑制的轉(zhuǎn)基因豬模型，研究GIP在糖代謝穩(wěn)態(tài)中的作用。
　　方法:對2月齡和5月齡的GIPRdn轉(zhuǎn)基因和野生型長白豬進行口服葡萄糖耐量測試，分析血糖和胰島素含量。糖耐量測試結(jié)束，分離豬的胰腺，稱重，免疫組化方法分析GIPRdn轉(zhuǎn)基因和野生型長白豬胰腺中Ki67和Insulin的表達水平。
　　結(jié)果:GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬2月齡口服糖耐量測試1h后，血糖明顯高于對照組，1.5h后胰島素含量也明顯比對照組高，證明GI

6、PRdn轉(zhuǎn)基因豬糖耐量確實受到損害;5月齡口服葡萄糖1.5h后，血糖也明顯低于對照組，而胰島素僅僅0.5h后就明顯高于對照組，確認GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬糖耐量依然受到損害。GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬從2月齡到5月齡表現(xiàn)出糖耐量受損基本沒有變化，而胰島素分泌明顯減少。GIPR血轉(zhuǎn)基因豬胰腺重量明顯減輕。免疫組織化學顯示insulin明顯降低，胰腺細胞增殖明顯減少。
　　結(jié)論:過表達顯性抑制的GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬從2月齡到5月齡表現(xiàn)出糖耐量受