豬Sirtuin家族基因的克隆及脂肪生成中SIRT3的功能研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的Sirtuin因子是酵母SIR2的同源蛋白質(zhì)家族，包含SIRT1-SIRT7共7個(gè)。這7個(gè)因子在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老以及代謝等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，是當(dāng)今能量與物質(zhì)代謝，癌癥發(fā)生，長(zhǎng)壽與衰老等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。當(dāng)前有關(guān)Sirtuin的研究主要集中在少數(shù)模式生物和人類，豬作為人類重要的肉食來(lái)源和典型的脂肪沉積動(dòng)物，有關(guān)豬Sirtuin家族基因及其與脂肪代謝相關(guān)功能的研究對(duì)闡明生物中脂肪沉積的機(jī)理以及疾病防治具有重要意義。

2、>　　肥胖是二型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的誘因之一，伴隨著人類物質(zhì)生活水平的提高而呈現(xiàn)高發(fā)趨勢(shì)，這類疾病的防治與治療也是當(dāng)前生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。新生脂肪細(xì)胞的分化與脂肪的沉積是導(dǎo)致肥胖的主要原因，脂肪細(xì)胞的發(fā)育分化過(guò)程也伴隨著線粒體的生成、分裂、融合以及清除，線粒體介導(dǎo)的物質(zhì)代謝為脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積提供必需的能量，代謝產(chǎn)生ROS又可介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、物質(zhì)代謝和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。
　　SIRT

3、3是Sirtuin家族中主要定位在線粒體中且是線粒體內(nèi)的主效去乙?；福渫ㄟ^(guò)調(diào)控線粒體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)的乙?；揎?，調(diào)控線粒體的生長(zhǎng)、發(fā)育和新陳代謝過(guò)程。不同剪接體的SIRT3也可以定位于細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)對(duì)Histone4，Ku70，F(xiàn)OXO3a等因子的去乙?；{(diào)控，參與細(xì)胞對(duì)ROS等脅迫反應(yīng)的調(diào)控。
　　本研究分離和鑒定了豬Sirtuin家族7個(gè)基因，對(duì)比分析了Sirtuin家族中7個(gè)因子的結(jié)構(gòu)和功能特征，用輻射雜種板技術(shù)和序列比

4、對(duì)將SIRT1-7定位在豬的相應(yīng)染色體區(qū)段，選取代表性物種的Sirtuin蛋白進(jìn)行了分子進(jìn)化樹(shù)的分析。以3T3L1細(xì)胞成脂分化為模型，研究了SIRT3在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)線粒體清除的調(diào)控作用，全文得到以下結(jié)果:
　　1.通過(guò)同源序列法克隆了豬Sirtuin家族7個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。豬Sirtuin家族7個(gè)因子的開(kāi)放式閱讀框的大小在1371bp到4064bp之間，分別編碼258到742個(gè)氨基酸不等。豬的Sirtuin家族因子

5、的編碼區(qū)與其它脊椎動(dòng)物的同源蛋白具有83％-92％的相似性，預(yù)測(cè)的氨基酸序列與酵母的SIR2蛋白也保有38％-56％的同一性，酶活性域的同一性在高等哺乳動(dòng)物間可達(dá)90％。
　　2.通過(guò)基因組PCR和可利用的豬DNA數(shù)據(jù)，獲得并分析豬SIRT1的基因及啟動(dòng)子區(qū)。通過(guò)輻射雜種板技術(shù)和可利用的豬基因組信息，將豬的Sirtuin家族7個(gè)基因分別定位在14q23，6q11-12，2q29，14q19，7p12，2q11，12p15上，各個(gè)基

6、因在染色體上的位置與人Sirtuin基因在染色體上的位置相似。利用已有的豬基因組DNA數(shù)據(jù)和基因組PCR，獲得了豬SIRT6的兩個(gè)剪接突變體和基因組結(jié)構(gòu)，并與人SIRT6的潛在突變體進(jìn)行了比較分析。
　　3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了SIRT1-7以及SIRT6的兩個(gè)剪接突變體在16個(gè)組織樣本中的表達(dá)水平，7個(gè)基因在所有的組織中均有表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸的表達(dá)量為最高。
　　4.首次利用29個(gè)代表性物種共93條非冗余SIR2家族因

7、子氨基酸序列，進(jìn)行了Sirtuin的進(jìn)化分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)樹(shù)型顯示Sirtuin家族因子可以分成兩個(gè)亞族，亞族又可以進(jìn)一步分為SIRT1/2/3，SIRT4，SIRT5，SIRT6/7等亞群。
　　5.脂肪細(xì)胞分化初期伴隨著線粒體的大量生成，而在分化后期線粒體數(shù)量顯著減少。DHE染色顯示成脂分化期間ROS的濃度也存在先上升后下降的趨勢(shì)，且峰值滯后于線粒體數(shù)量峰值出現(xiàn)。
　　6.克隆了小鼠SIRT3啟動(dòng)子，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其中存在

8、典型的PPAR-γ結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析，PPAR-γ激動(dòng)劑和抑制劑處理，RNAi以及基因共表達(dá)證實(shí)SIRT3受PPAR-γ的正調(diào)控，ChIP證實(shí)PPAR-γ主要通過(guò)結(jié)合SIRT3啟動(dòng)子區(qū)域中-3771/-3610位點(diǎn)來(lái)調(diào)控SIRT3的表達(dá)。
　　7.脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，伴隨著SIRT3和Beclin-1等基因的上調(diào)表達(dá)，二者的時(shí)空表達(dá)模式與PPAR-γ極為相似，且干擾PPAR-γ的表達(dá)，SIRT3和Beclin-1的表