曲安奈德及普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞體外增殖的研究.pdf

1、背景：
　　瘢痕疙瘩(keloid,KD)是皮膚受損后形成的一種病理性瘢痕，臨床上以疼痛、瘙癢等感覺異常為主要表現(xiàn)，呈進(jìn)行性生長，并逐漸侵襲周圍正常組織，單純切除后復(fù)發(fā)率較高，并且新生瘢痕可能超過原有瘢痕，這與良性腫瘤有很大的相似之處。其在組織學(xué)上，KD主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）的過度增生以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原過度聚集為特征，在皮膚受到創(chuàng)傷后，在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞被激活并大量增殖。與此同時成纖維細(xì)胞

2、合成大量的膠原并可以產(chǎn)生多種修復(fù)因子促進(jìn)組織的愈合與修復(fù)。以致局部組織過度膠原纖維化，形成蟹足樣外觀，給患者造成一定的心理負(fù)擔(dān)，發(fā)生在關(guān)節(jié)等處的KD還會在某種程度上導(dǎo)致患者的功能障礙。
　　目前，治療瘢痕疙瘩的機(jī)制主要有減少和抑制瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原的合成、抑制成纖維細(xì)胞的DNA合成促進(jìn)其凋亡、增強(qiáng)膠原酶的活性促進(jìn)膠原的降解等。有關(guān)研究表明：瘢痕疙瘩的形成、發(fā)生以及發(fā)展過程中，一些細(xì)胞因子及其相關(guān)受體表達(dá)異常，例如：

3、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等。這些相關(guān)因子中TGF-β1是目前為止較為確切的因子，在創(chuàng)傷發(fā)生后，TGF-β1首先高水平表達(dá)于新生的血管中，進(jìn)而激活周圍的成纖維細(xì)胞并使其高表達(dá)

4、TGF-β1,而TGF-β1在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的同時，并能夠刺激Ⅰ,Ⅲ膠原為主的多種細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）蛋白的分泌,使ECM過度沉積，從而形成瘢痕疙瘩。
　　除此之外，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞除了合成和分泌大量膠原蛋白外，在修復(fù)創(chuàng)傷的過程中，在缺氧微環(huán)境下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞可促進(jìn)VEGF, AngⅠ等血管因子的表達(dá)增加，并誘導(dǎo)和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的能力增強(qiáng)，這些促血管生長因子可能是造成

5、瘢痕疙瘩呈侵襲性生長的一個重要原因，而 VEGF是目前已知的血管生成因子中活性最強(qiáng)的，可以增強(qiáng)血管內(nèi)細(xì)胞的活性并促進(jìn)其分裂增殖，從而促進(jìn)瘢痕疙瘩組織內(nèi)部的血管密度增加，進(jìn)而為瘢痕疙瘩的向外周正常組織的侵襲提供豐富血供。
　　曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA），是目前臨床上治療瘢痕疙瘩的首選藥物,主要是利用其強(qiáng)大的抑制炎癥反應(yīng)能力和抑制瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖的作用，可減輕非感染性和感染性炎癥早期的組織充

6、血、細(xì)胞反應(yīng)及液體滲出等癥狀，并抑制組織愈合過程中肉芽組織的形成以及瘢痕過度生長。
　　普萘洛爾（Propranolol，P）作為治療心血管疾病常用的β受體阻滯劑。2002年O’Callaghan CJ發(fā)現(xiàn)其具有抗纖維化和抑制膠原蛋白形成的效果，作用機(jī)制主要是通過競爭性抑制TGF-β1受體，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的生物活性，減少膠原的分泌，從而達(dá)到抗纖維化的作用。此外，普萘洛爾可能通過抑制ERK/MARK信號通路，從而使增殖期血管瘤V

7、EGF的分泌減少。在血管瘤后期的治療過程中，普萘洛爾可以通過下調(diào)MAPK信號通路，從而抑制VEGF和bFGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管瘤的進(jìn)一步消退。而瘢痕疙瘩的形成離不開成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原的沉積，亦離不開豐富的血供。2010年,DE Mesquita CJ提出了用普萘洛爾治療瘢痕疙瘩的假說,目前關(guān)于普萘洛爾治療瘢痕疙瘩的研究較少。此外，雖然曲安奈德治療瘢痕疙瘩是目前臨床上藥物治療瘢痕疙瘩的首選，但濃度仍然沒有達(dá)成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。
　

8、　目的：
　　1.本實(shí)驗(yàn)擬以體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞為研究對象，探討不同濃度的普萘洛爾及曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF的表達(dá)；
　　2.篩選出普萘洛爾與曲安奈德抑制成纖維細(xì)胞增殖的有效藥物濃度，比較兩者藥效之間的不同。
　　3.為普萘洛爾在臨床防治瘢痕疙瘩中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.標(biāo)本來源為臨床瘢痕疙瘩患者，并經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科證實(shí)

9、為KD。
　　2.采用兩步胰蛋白酶消化法，提取瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，并在體外原代貼壁培養(yǎng)，傳代純化。
　　3.取傳代培養(yǎng)至第三代，生長良好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，利用免疫細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)，檢測CD73, CD90和CD105間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的表達(dá)，對成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　4.用不同濃度(0mg/ml,0.05mg/ml,0.10mg/ml,0.20mg/ml,0.40mg/ml,0.80mg

10、/ml,1.6mg/ml,3.2mg/ml,6.4mg/ml)的普萘洛爾及曲安奈德處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24h,48h,72h；不加藥培養(yǎng)基為陰性對照。
　　5.采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測普萘洛爾及曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和活力的影響。
　　6.采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測其TGF-β1, VEGF,Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。采用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)

11、果：
　　1.瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的鑒定
　　光鏡下，觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的形態(tài)，以長梭形為主，胞體外圍有突起，細(xì)胞核呈橢圓形并位于胞體中間，呈平形狀、放射狀生長，結(jié)合成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、生長特性及成纖維細(xì)胞表面的CD73, CD90, CD105的表達(dá)，并聯(lián)系臨床診斷，確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞是瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。
　　2.曲安奈德及普萘洛爾對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響
　　2.1 MTT法顯示：
　　2.1.1

12、 曲安奈德在一定濃度下對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且抑制作用有明顯的時間和濃度依賴性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范圍內(nèi)，曲安奈德濃度越高，對成纖維細(xì)胞的生長抑制率越高（P＜0.05）；隨著藥物時間的延長，其抑制率越高（P＜0.05）。24h,48h,72h的IC50分別為5.2mg/ml,3.88mg/ml,1.91mg/ml，選用72h的IC50作為藥物試驗(yàn)濃度。
　　2.1.2 普萘洛爾在一定濃度

13、下對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖能力具有抑制作用，并且抑制作用有明顯的濃度和時間依賴性。在0.05mg/ml~6.4mg/ml范圍內(nèi)，普萘洛爾濃度越高，對成纖維細(xì)胞的生長抑制率越高（P＜0.05）；隨著藥物作用時間的延長，其抑制率越高（P＜0.05）。24h,48h,72h的IC50分別為6.2mg/ml,4.92mg/ml,2.84mg/ml，選用72h的IC50作為藥物試驗(yàn)濃度。
　　2.2 Western Blot法顯示

14、　　曲安奈德及普萘洛爾均對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的Ⅰ,Ⅲ膠原及 TGF-β1, VEGF的表達(dá)均有明顯抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.曲安奈德及普萘洛爾對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞均有明確的抑制作用，其作用強(qiáng)弱有所不同，整體來看，曲安奈德對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的抑制作用大于普萘洛爾，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.曲安奈德及普萘洛爾均可抑制 TGF-β1, VEGF表達(dá),Ⅰ及Ⅲ型膠原的分泌，除了 VE