雷公藤紅素抑制Ca2+-CaMKII依賴(lài)的Akt-mTOR通路干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究.pdf

1、本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、熒光染色、RNA干擾、MTS分析、Western blotting等細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)及方法，綜合研究了在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中，雷公藤紅素的保護(hù)作用;基于鎘激活A(yù)kt/mTOR通路探討了雷公藤紅素抗鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)理;進(jìn)一步研究了雷公藤紅素調(diào)控Ca2+和CaMKⅡ在阻滯鎘激活A(yù)kt/mTOR通路及保護(hù)抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中作用及其分子機(jī)理。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴PC12細(xì)胞及原代神經(jīng)元用Cela

2、strol(1μM)預(yù)處理1h后用Cd(10和20μM)處理8h或24 h。用Fluo-3/AM探針?lè)治鯷Ca2+]i熒光強(qiáng)度、MTS分析細(xì)胞活性、Western blot分析Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)、DAPI分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，Cd能引起細(xì)胞[Ca2+]i熒光強(qiáng)度和凋亡的增加及細(xì)胞活性降低，同時(shí)Cd還能引起Cleaved-caspase-3蛋白和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)增

3、加，用Celastrol預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)Cd引起的這些變化。提示:雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i升高干預(yù)鎘誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡。⑵PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元、或Ad-dn-Akt或Ad-GFP感染的PC12細(xì)胞用AktinhibitorⅩ（20μM）預(yù)處理1h再用Celastrol(1μM)預(yù)處理1h后用Cd(10和/或20μM)處理8h或24 h。用Western blot分析Akt/mTOR相關(guān)蛋白和Cleaved-casp

4、ase-3蛋白的表達(dá)、DAPI分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，Celastrol、Akt inhibitorⅩ或鈍化Akt后均明顯抑制鎘誘導(dǎo)Akt、S6K1和4E-BP1磷酸化和Cleaved-caspase-3表達(dá)以及細(xì)胞凋亡，而Akt inhibitorⅩ或鈍化Akt后加強(qiáng)Celastrol對(duì)鎘誘導(dǎo)的這些事件的抑制作用。提示:雷公藤紅素抑制Akt介導(dǎo)mTOR通路激活干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。⑶PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元先用BAPTA/AM(

5、20μM)或EGTA(100μM)預(yù)處理1h再用Celastrol(1μM)預(yù)處理1h后用Cd(10μM)處理8h或24 h。用Western blot分析Akt/mTOR相關(guān)蛋白及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、DAPI分析細(xì)胞凋亡情況、Fluo-3/AM探針?lè)治鯷Ca2+]i熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，BAPTA/AM、EGTA或Celastrol均能顯著抑制鎘引起的細(xì)胞[Ca2+]i升高，BAPTA/AM或EGTA能加強(qiáng)Cel

6、astrol抑制鎘誘導(dǎo)細(xì)胞[Ca2+]i升高。BAPTA/AM、EGTA或Celastrol也明顯阻滯鎘誘導(dǎo)細(xì)胞Akt、S6K1和4E-BP1磷酸化以及Cleaced-caspase-3和凋亡增加，而B(niǎo)APTA/AM或EGTA更有力地強(qiáng)化Celastrol抑制作用。提示:雷公藤紅素抑制Ca2+依賴(lài)的Akt/mTOR通路干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。⑷PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元用BAPTA/AM(20μM)或EGTA(100μM)預(yù)處理1h再用C

7、elastrol(1μM)預(yù)處理1h后用Cd（10和/或20μM）處理8h，或用KN93(10μM)或/和Celastrol(1μM)預(yù)處理1h后用Cd(10μM)處理8h或24 h。用Western blot分析Akt/mTOR相關(guān)蛋白及CaMKⅡ和Cleaved-caspase-3表達(dá)、DAPI分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，BAPTA/AM、EGTA、KN93增強(qiáng)雷公藤紅素對(duì)鎘引起的CaMKⅡ磷酸化的抑制作用。KN93抑制CaMKⅡ能