水流動力學(xué)方法直接重編程小鼠肝細(xì)胞為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病是危害人類健康的全球性疾病，在中國發(fā)病率約為8％，并且仍以每年200萬人的速率增加。若將糖尿病患者體內(nèi)的肝細(xì)胞直接重編程為胰島β細(xì)胞，有望解決糖尿病患者胰島β細(xì)胞缺乏和胰島素分泌不足的問題。本研究探索應(yīng)用水流動力學(xué)基因轉(zhuǎn)染方法將小鼠肝細(xì)胞直接重編程為胰島素分泌細(xì)胞的可能性，觀察體內(nèi)外小鼠肝細(xì)胞直接重編程為胰島素分泌細(xì)胞的效率、治療效果和安全性。
　　方法：
　　通過改良的兩步法分離、純化原代小鼠肝細(xì)胞

2、，用腺病毒載體將Pdx1、Ngn3和MafA導(dǎo)入分離純化的原代小鼠肝細(xì)胞，對直接重編程后的細(xì)胞，qRT-PCR檢測誘導(dǎo)后不同時間點(diǎn)胰島β細(xì)胞發(fā)育標(biāo)志性基因mRNA的表達(dá)，免疫熒光檢測胰島β細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表達(dá)，ELISA檢測不同濃度葡萄糖刺激后胰島素分泌水平。利用水流動力學(xué)轉(zhuǎn)染試劑通過尾靜脈將Pdx1、Ngn3和MafA等轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入糖尿病小鼠模型體內(nèi)，動態(tài)觀察小鼠血糖和體重變化；在第7、14、28、56和100天分別進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)，眼

3、眶靜脈叢取血ELISA檢測小鼠血清中胰島素含量變化和肝臟功能蛋白AST和ALT的變化；取小鼠肝臟組織，提取總RNA。qRT-PCR檢測肝臟組織內(nèi)胰島β細(xì)胞發(fā)育標(biāo)志性基因mRNA的表達(dá)，冰凍切片組織進(jìn)行免疫熒光檢測胰島β細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　通過改良的原位肝細(xì)胞灌注法獲得高活性、高純度的原代小鼠肝細(xì)胞；通過腺病毒載體將Pdx1、Ngn3和MafA轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入原代小鼠肝細(xì)胞。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，直接重編程細(xì)

4、胞內(nèi)胰島β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)隨著編程時間延長逐漸增強(qiáng)，在直接重編程后第5天，Ins1和 Ins2基因的表達(dá)達(dá)到最高峰。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞標(biāo)志性蛋白insulin的表達(dá)，但ELISA檢測高濃度（25Mm）葡萄糖刺激后胰島素分泌水平未見明顯增高。利用水流動力學(xué)轉(zhuǎn)染試劑對糖尿病模型小鼠肝細(xì)胞直接重編程，糖尿病小鼠血糖逐步降低至正常血糖水平，體重逐步增加；糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示隨著編程時間的延長，直接重編程的胰島素分泌細(xì)胞對血糖的的調(diào)節(jié)能力

5、逐漸增強(qiáng)；小鼠肝組織冰凍切片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)肝臟有胰島素陽性細(xì)胞，具有成團(tuán)呈島樣結(jié)構(gòu)；qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)肝臟組織內(nèi)有胰島β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。血清 ELISA檢測胰島素分泌隨直接重編程時間延長分泌增多，AST和ALT水平隨時間降低，肝功能恢復(fù)至正常小鼠水平。
　　結(jié)論：
　　肝臟和胰腺共同起源于腹部前腸內(nèi)胚層，利用細(xì)胞直接重編程技術(shù)將轉(zhuǎn)錄因子組合Pdx1，Ngn3和MafA導(dǎo)入原代小鼠肝細(xì)胞和糖尿病模型小鼠，可將肝細(xì)