小鼠OG-MEF細胞重編程過程中細胞動力學研究和牛TWSIN-OG細胞誘導(dǎo)重編程的初步研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一章 小鼠OG-MEF細胞重編程過程中細胞動力學研究
　　誘導(dǎo)多能性干細胞相比胚胎干細胞具有無可比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為研究細胞增殖、分化和再生醫(yī)學的重要技術(shù)手段。前人的研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs的產(chǎn)生過程中細胞將經(jīng)歷三種形態(tài)變化:成纖維細胞型(MEF)→上皮樣細胞→胚胎干細胞樣克隆(iPSCs)，了解重編程過程中三種不同形態(tài)細胞的動力學變化，對于闡明iPSCs的重編程機理以及提高其誘導(dǎo)效率具有重要

2、作用。為此，本研究建立了無飼養(yǎng)層條件下誘導(dǎo)iPSCs的技術(shù)方法，同時比較了兩種不同的培養(yǎng)液添加物（血清和血清替代物）對于iPSCs誘導(dǎo)效率的影響。進而，利用Thy1、SSEA1兩種抗體染色和Oct4-GFP報告系統(tǒng)，對重編程過程中PD3、PD6、PD9、PD12細胞的動力學變化規(guī)律進行了分析。結(jié)果顯示，含血清替代物的培養(yǎng)液中iPSCs的誘導(dǎo)效率顯著高于血清培養(yǎng)液(15.2％ vs2.59％)，且含血清替代物培養(yǎng)液中誘導(dǎo)獲得的iPSCs在

3、細胞克隆形態(tài)，Oct4-GFP表達等方面明顯優(yōu)于血清培養(yǎng)液。進而，本研究利用無飼養(yǎng)層及血清替代物培養(yǎng)液為誘導(dǎo)系統(tǒng)，對誘導(dǎo)過程中PD3、PD6、PD9、PD12天的細胞染色進行流式分析，探討重編程過程不同階段細胞特性標記的動力學變化。結(jié)果顯示，在PD3時，Thy1+SSEA1-細胞占68.6％，Thy1-SSEA1-細胞占23.8％，Thy1-SSEA1+細胞占6.63％。PD6時，Thy1+SSEA1-細胞數(shù)量顯著降低至16.8％，而T

4、hy1-SSEA1-細胞達到55.1％，Thy1-SSEA1+細胞數(shù)量顯著提升至27.3％，所以在重編程的早期，細胞表面標記的變化為Thy1+ SSEA1-細胞→Thy1-SSEA1-細胞→Thy1-SSEA1+細胞。PD9時， SSEA1-GFP+細胞所占比例為12.6％，SSEA1-GFP-所占的比例為18.2％，SSEA1+GFP+細胞所占的比例為51.7％，在PD12時，SSEA1-GFP+細胞所占的比例上升為23.8％，SSE

5、A1-GFP-細胞所占的比例下降到11.6％，而SSEA1+GFP+細胞所占的比例上升到57.5％。所以誘導(dǎo)的后期，重編程細胞由SSEA1+GFP-細胞→SSEA1+GFP+細胞。因此，整個重編程過程中細胞特性標記的動力學變化規(guī)律為，Thy1+SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1+ GFP?！鶷hy1-SSEA1+GFP+。將流式分選的Thy1-SSEA1+GFP+細胞接種于飼養(yǎng)層上進行培養(yǎng)，形成的

6、iPSCs克隆形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，克隆邊緣整齊、有明顯的遮光，且都表達GFP綠色熒光，堿性磷酸酶染色都呈陽性。對其進行免疫熒光染色分析顯示，多能性標記蛋白Oct4、Sox2、Nanog、 E-cadherin、SSEA1均呈陽性染色。該iPSCs能夠體外分化形成類胚體，并表達三胚層標記蛋白，Nestin（外胚層）、Brachyury（中胚層）和Gata4(內(nèi)胚層)。
　　第二章 牛TWSIN1-OG細胞誘導(dǎo)重編程的初步研究

7、r>　　體細胞導(dǎo)入特異性轉(zhuǎn)錄因子，可將已分化的細胞重編程為具有干細胞特性的誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），iPS技術(shù)為牛、羊、豬等胚胎干細胞建系困難的大家畜動物提供一種獲得多能干細胞的新途徑。雖然目前已獲得了具有部分多能性的牛iPSCs，但這些iPSCs都不能在體外進行長期培養(yǎng)，并依賴外源轉(zhuǎn)錄因子的長期表達來維持克隆形狀，而內(nèi)源干細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并沒有被激活，當轉(zhuǎn)錄因子的表達被沉默

8、后，iPSCs立即分化，且不同研究所獲得的iPSCs在細胞形態(tài)和多能性基因的表達等方面還存在明顯差異。將Oct4-GFP報告系統(tǒng)應(yīng)用于iPSCs重編程，為判斷重編程過程中內(nèi)源干性網(wǎng)絡(luò)的是否激活提供了有力的技術(shù)手段。本研究構(gòu)建了含有人Oct4-GFP報告基因的牛胎兒成纖維細胞（TWSIN1-OG），用以判斷牛iPSCs誘導(dǎo)重編程過程中內(nèi)源干性網(wǎng)絡(luò)的激活。通過將人源的OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28(OSKM

9、NL)導(dǎo)入TWSIN1-OG細胞，進而誘導(dǎo)牛iPSCs。當使用不同體積的病毒感染細胞，通過DsRed紅色熒光蛋白指示感染效率，結(jié)果顯示，使用10μl、20μl、30μl、40μl病毒的感染效率分別為54.3％、62.2％、74.8％、79.3％。進而確定使用40μl的OSKMNL病毒進行牛iPSCs的誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)過程中細胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與小鼠類似，在誘導(dǎo)第三天細胞開始由成纖維細胞型向上皮樣細胞轉(zhuǎn)變，第六天上皮樣的細胞開始向上聚