應(yīng)用多組學(xué)策略篩選肝癌候選標(biāo)志物及NEK2和HSP90α的驗(yàn)證.pdf

1、背景：
　　生物標(biāo)志物（biomarkers）的研究是預(yù)防醫(yī)學(xué)核心研究內(nèi)容之一，它是一種具有能夠客觀測量并評價(jià)一般生物過程、病理過程或?qū)︶t(yī)療干預(yù)相關(guān)藥物反應(yīng)的指示物，也是生物體受到損害后的重要預(yù)警指標(biāo)，涉及到細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)和功能的改變，生理活動的異常變化，生化代謝過程的改變，個體、群體或整個生態(tài)系統(tǒng)的異常表現(xiàn)等。生物標(biāo)志物的研究為有效地預(yù)防和控制健康危害提供了理論依據(jù)。近年來隨著分子生物學(xué)及相關(guān)前沿生命學(xué)科的深入發(fā)展，生物標(biāo)志物的研

2、究已成為國內(nèi)外預(yù)防醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的熱點(diǎn)，被稱為是環(huán)境醫(yī)學(xué)發(fā)展到分子水平的一個重要里程碑，其研究在分子流行病學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生學(xué)、勞動衛(wèi)生學(xué)、分子毒理學(xué)等諸多領(lǐng)域的價(jià)值是十分重要的。在環(huán)境流行病學(xué)的研究中，腫瘤分子標(biāo)志物的研究對于預(yù)測腫瘤風(fēng)險(xiǎn)、評估臨床治療效果、判斷預(yù)后及指導(dǎo)三級預(yù)防等方面起了重要作用，因此被得到廣泛應(yīng)用。
　　原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示，近年來肝癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率

3、和死亡率分別位居男性惡性腫瘤的第5位和第2位、女性惡性腫瘤的第7位和第6位。其中，我國肝癌的新發(fā)病例和死亡病例數(shù)約占全球的一半左右，其死亡率僅次于胃癌。根據(jù)我國2010年腫瘤登記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，廣西肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為43.76/10萬和35.82/10萬，均分別高于全國的肝癌發(fā)病率（28.71/10萬）和死亡率（26.04/10萬），位于全部惡性腫瘤死亡的第一位。隨著人口老齡化的加劇，肝癌的發(fā)病/死亡絕對數(shù)將會進(jìn)一步上升，有研究表

4、明，預(yù)計(jì)到2030年肝癌的發(fā)病/死亡人數(shù)將增加60％。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）具有惡性程度高，治療困難，發(fā)展速度快，生存時間短的特點(diǎn)，5年生存率不足10%。原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床病象極不典型，其癥狀一般多不明顯，特別是在病程前期。目前，由于缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，使得其只有30%~40%的肝癌患者可以獲得及時診斷和有效治療。因此迫切需要尋找一種特異度和敏感度均較高的肝癌標(biāo)志物，以提高肝癌

5、的早期診斷水平，保證患者的預(yù)后。
　　腫瘤的發(fā)生與發(fā)展涉及到基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多個不同層次的病理過程。單組學(xué)數(shù)據(jù)分析是傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的研究策略，往往只能體現(xiàn)出疾病樣本其中一個層面的變化，在篩選腫瘤標(biāo)志物方面具有局限性。通過對多層次多組學(xué)數(shù)據(jù)的交集分析，將有助于人們更加系統(tǒng)全面的認(rèn)識腫瘤的生物學(xué)行為，進(jìn)一步為尋找有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物和探討腫瘤相關(guān)機(jī)制提供新的線索。利用多種組學(xué)技術(shù)目前已成為腫瘤研究領(lǐng)域新興的熱點(diǎn)方向。

6、r>　　本研究將多種組學(xué)研究策略運(yùn)用于肝癌標(biāo)志物的篩選和鑒定：（1）采用細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析策略，尋找肝癌細(xì)胞和組織中共有的差異表達(dá)基因；（2）采用血清蛋白組學(xué)結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析策略，篩選肝癌血清和細(xì)胞中共有的差異表達(dá)因子。然后通過生物信息學(xué)分析其生物學(xué)特性及功能，進(jìn)一步利用qRT-PCR、免疫組化、Western blotting等技術(shù)驗(yàn)證差異因子在肝癌細(xì)胞、組織及血清中的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料分析及生存率分析，為

7、肝癌的防治研究提供有價(jià)值的腫瘤分子標(biāo)志物。
　　第一部分轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序篩選肝癌潛在標(biāo)志物NEK2
　　目的：
　　利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞與肝癌組織中共有的差異表達(dá)基因，并驗(yàn)證其在肝癌細(xì)胞和組織的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病理資料分析和通路相關(guān)因子的關(guān)聯(lián)分析，探討其作為標(biāo)志物在肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用Ion Proton轉(zhuǎn)錄組測序平臺對肝癌細(xì)胞SMMC-7721和正常肝細(xì)胞L-

8、02進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙端測序，獲得差異表達(dá)基因。
　　2.將細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行交集分析，得到共有的差異表達(dá)基因，并將差異表達(dá)最為明顯的基因列為候選標(biāo)志物。
　　3.利用qRT-PCR驗(yàn)證候選標(biāo)志物NEK2基因在肝癌細(xì)胞SMMC-7721和正常肝細(xì)胞L-02，以及5例肝癌和癌旁組織中的表達(dá)水平；免疫組化驗(yàn)證候選標(biāo)志物NEK2蛋白在63例肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。
　　4.分析候選標(biāo)志物NEK2的表達(dá)與63

9、例肝癌樣本臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　5.對候選標(biāo)志物可能涉及通路中的關(guān)鍵蛋白p-AKT和MMP-2進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞SMMC-7721與正常肝細(xì)胞L-02中共得到差異表達(dá)基因611個，其中肝癌細(xì)胞中上調(diào)368個，下調(diào)243個。
　　2.將細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異表達(dá)基因進(jìn)行交集分析，可以得到12個共有的差異表達(dá)基因，在肝癌中表達(dá)上調(diào)基因10個，表達(dá)下調(diào)

10、基因2個，其中NEK2在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)中差異最為明顯，因此將NEK2基因作為驗(yàn)證的候選標(biāo)志物。
　　3.驗(yàn)證結(jié)果表明，NEK2 mRNA在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的相對表達(dá)量為0.024±0.0026，是正常肝細(xì)胞L-02表達(dá)量0.014±0.0003的1.71倍（P=0.002）；NEK2 mRNA在肝癌組織中的相對表達(dá)量為5.60±3.69，是癌旁組織表達(dá)量0.34±0.38的16.47倍（P=0.013）；N

11、EK2蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P=0.000）。
　　4.肝癌臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，NEK2、p-AKT和MMP-2在腫瘤大小≤10 cm組的表達(dá)水平均分別是腫瘤大小>10 cm組的1.58倍（P=0.024）、2.24倍（P=0.041）和2.29倍（P=0.013），NEK2和MMP-2在包膜不完整組的表達(dá)水平分別是包膜完整組的1.91倍（P=0.000）和2.04倍（P=0.009），NEK2、p-AKT

12、和MMP-2在多結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平分別是單結(jié)節(jié)組的1.62倍（P=0.012）、2.40倍（P=0.046）和2.04倍（P=0.024），NEK2和p-AKT在復(fù)發(fā)組中的表達(dá)水平分別是非復(fù)發(fā)組的2.09倍（P=0.004）和3.24倍（P=0.045）。
　　5.關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，肝癌組織中NEK2的表達(dá)與p-AKT和MMP-2均成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.832（P<0.01）和r=0.763（P<0.01）。

13、>　　結(jié)論：
　　NEK2很可能是具有重要功能的肝癌標(biāo)志物，并且其表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能通過激活PI3K/AKT信號通路增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第二部分轉(zhuǎn)錄組結(jié)合蛋白組學(xué)篩選肝癌潛在標(biāo)志物HSP90α
　　目的：
　　利用蛋白組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)的策略篩選肝癌細(xì)胞與肝癌血清中共有的差異表達(dá)因子，驗(yàn)證其在肝癌細(xì)胞、血清和組織的表達(dá)水平，及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采

14、用iTRAQ-LC-MALDI-TOF/TOF蛋白組學(xué)技術(shù)對10例人肝癌血清和10例正常對照組血清進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肝癌相關(guān)差異表達(dá)蛋白。
　　2.將血清蛋白組學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行交集分析，得到共有的差異表達(dá)因子，并將差異表達(dá)最為明顯的因子列為候選標(biāo)志物。
　　3.利用qRT-PCR驗(yàn)證候選標(biāo)志物HSP90α在肝癌細(xì)胞SMMC-7721和正常肝細(xì)胞L-02中的表達(dá)水平；Western blotting、ELISA驗(yàn)證HS

15、P90α在7例肝癌血清和7例正常對照血清中表達(dá)水平；免疫組化驗(yàn)證HSP90α蛋白在76例肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。
　　4.分析候選標(biāo)志物HSP90α的表達(dá)與76例肝癌樣本臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.蛋白組學(xué)結(jié)果顯示，在人肝癌血清和正常對照組血清中共鑒定出31個差異表達(dá)蛋白，其中在肝癌血清中上調(diào)17個，下調(diào)14個。
　　2.將血清蛋白組學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異表達(dá)因子進(jìn)行交集分析，可以得到3

16、個共有的差異表達(dá)因子，在肝癌中表達(dá)上調(diào)2個，表達(dá)下調(diào)1個，其中HSP90α在血清蛋白組學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中差異最為明顯，因此將HSP90α基因作為驗(yàn)證的候選標(biāo)志物。
　　3.驗(yàn)證結(jié)果顯示，HSP90α mRNA在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)水平是正常肝細(xì)胞L-02表達(dá)水平的4.18倍（P<0.05）；Western blotting結(jié)果顯示HSP90α蛋白在肝癌血清中的表達(dá)水平是正常對照組的7.26倍（P<0.05）；ELIS

17、A結(jié)果顯示HSP90α在肝癌血清中的表達(dá)量為273.6±20.3μg/ml，也明顯高于在正常對照組血清的表達(dá)量186.2±18.3μg/ml（P<0.05）；HSP90α蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P<0.05）。
　　4.肝癌臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，HSP90α在肝癌轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中被判定為強(qiáng)陽性的比例分別為66.7%和25%，在肝癌轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平顯著高于非轉(zhuǎn)移組（P=0.010）。
　　結(jié)論：

18、　　HSP90α可能是重要的肝癌標(biāo)志物，并且與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。
　　第三部分 NEK2和HSP90α診斷肝癌的價(jià)值及生存率分析
　　目的：
　　利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌患者數(shù)據(jù)，進(jìn)一步評估NEK2和HSP90α在診斷肝癌的價(jià)值及生存率分析，探討其臨床應(yīng)用的可行性。
　　方法：
　　1.下載TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌的RNASeqV2數(shù)據(jù)，分別計(jì)算NEK2基因和HSP90α基因在359例肝癌及癌旁組織

19、中的表達(dá)差異性。
　　2. ROC曲線分析，獲得NEK2和HSP90α對肝癌診斷的最佳臨界點(diǎn)、AUC及診斷靈敏度與特異度。
　　3.根據(jù)ROC曲線提供的診斷最佳臨界點(diǎn)，將肝癌患者分為NEK2和HSP90α高表達(dá)組和低表達(dá)組，并利用Kaplan-Meier生存曲線分析NEK2和HSP90α高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存率差異。
　　結(jié)果：
　　1. NEK2和HSP90α在肝癌組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)，其中NEK2在肝

20、癌組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的19.036倍（P<0.001），HSP90α是癌旁組織的1.399倍（P<0.001）。與HSP90α相比，NEK2在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的更為明顯。
　　2. NEK2和HSP90α對肝癌均有較好的診斷準(zhǔn)確性，并且NEK2診斷準(zhǔn)確性高于HSP90α，其AUC分別為0.960（P=0.003）和0.703（P=0.029）；NEK2和HSP90α對肝癌診斷的最佳臨界點(diǎn)分別為52.73和17971.78

21、；NEK2診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為0.98和0.82，HSP90α診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為0.88和0.55，與HSP90α相比，NEK2診斷肝癌顯示出更高的靈敏度和特異度。
　　3.生存曲線分析結(jié)果顯示，NEK2和HSP90α基因的表達(dá)情況均與患者生存率有關(guān)（P=0.0145和0.0032），并且高表達(dá)組患者生存率低于低表達(dá)組。
　　結(jié)論：
　　NEK2和HSP90α對肝癌均有較好的診斷價(jià)值，NEK2和H