肝癌候選標(biāo)志物NAP-2(73)在肝癌細(xì)胞和組織中的驗證實驗.pdf

1、肝癌是我國最常見、最具有危害性的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO于2005年的統(tǒng)計，全世界每年新增肝癌患者62萬，約59萬人死于肝癌，在我國每年有20～30萬人死于肝癌，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康，因而一直是我國研究的重點腫瘤之一。而肝癌早期一般無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已屆入中晚期。近幾十年來，肝癌總體預(yù)后并未得到顯著改善，難以明確診斷而失去手術(shù)的時機(jī)是重要的原因之一。因此尋找理想的生物標(biāo)記物，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的蛋白

2、質(zhì)分子，以用于肝癌的輔助診斷一直是肝癌研究領(lǐng)域的熱點和難點。 蛋白組學(xué)的出現(xiàn)為尋找新的腫瘤標(biāo)志物帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，也使尋找新的腫瘤標(biāo)志物成為可能。本課題組的前期研究中，成功地運用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選肝癌患者血清中可能肝癌標(biāo)記物，并在此基礎(chǔ)上對標(biāo)志蛋白分離、純化，質(zhì)譜鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，相對為分子量7984Da的標(biāo)志蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為嗜中性活性肽2(NAP-2(73))，該蛋白可能為肝癌的候選血清標(biāo)志物。 目的：

3、為了驗證SELDI篩選結(jié)果的可靠性，本研究通過制備NAP-2(73)多克隆抗體，研究嗜中性活性肽2(NAP-2(73))在肝癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)水平。 方法：采用DNAstart軟件設(shè)計NAP-2(73)抗原表位，免疫新西蘭家兔制備NAP-2(73)多克隆抗體。采用Western bolt及Real-time定量RT-PCR技術(shù)對NAP-2(73)在肝癌細(xì)胞株7721和正常肝細(xì)胞株7702中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，并運用免疫細(xì)胞學(xué)

4、的方法檢測NAP-2(73)在肝癌細(xì)胞株7721和正常肝細(xì)胞株7702表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，從廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科收集30例手術(shù)切除的肝癌及其癌旁組織，運用免疫組織化學(xué)的方法對NAP-2(73)在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測。 結(jié)果：NAP-2(73)多克隆抗體效價為1:729000。Westem bolt和免疫細(xì)胞學(xué)的結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞株中NAP-2(73)呈陽性表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞株中無表達(dá)。Real-

5、time PCR結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞株中NAP-2(73) mRNA表達(dá)比正常肝細(xì)胞株增加了7倍。NAP-2(73)在肝癌組織中表達(dá)率為100％，其中63.33％呈強陽性表達(dá)，癌旁組織無強陽性表達(dá)；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩者NAP-2(73)的表達(dá)呈顯著差異。 結(jié)論：NAP-2(73)在肝癌細(xì)胞株的表達(dá)率為100％，而在人正常肝細(xì)胞株中無表達(dá)，且在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在差異，驗證了初篩結(jié)果的可信性和生物信息學(xué)的分析和推測，提示NAP