反義Hpa cDNA對(duì)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力的抑制作用.pdf

1、本文探討了Hpa在不同轉(zhuǎn)移潛能人肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，分析它與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系：采用基因重組技術(shù)構(gòu)建Hpa反義真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ASHpa，通過轉(zhuǎn)染Hpa高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系，抑制Hpa在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為肺癌基因治療提供一定的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與研究方法： 1、用含有10％胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人肺巨細(xì)胞癌PG細(xì)胞系的

2、高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞亞系BE1、低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞亞系LH7和人肺腺癌低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系A(chǔ)2。 細(xì)胞爬片免疫組化染色：分別培養(yǎng)三種細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，85％冷乙醇固定15min，TritonX-100處理。采用鏈霉素抗生物素蛋白．過氧化物酶免疫組化法(S-P法)觀察Hpa蛋白表達(dá)情況。 RT-PCR：收集三種細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成eDNA，PCR擴(kuò)增Hpa，產(chǎn)物長度180bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察。以β-ac

3、tin為內(nèi)參，計(jì)算Hpa mRNA相對(duì)表達(dá)量。 Western blot：分別提取三種細(xì)胞蛋白，采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)印，Hpa一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗孵育后DAB顯色。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算Hpa蛋白相對(duì)表達(dá)量。 2、pcDNA3-Hpa質(zhì)粒含有1758bp的人Hpa cDNA片段，位于EcoR Ⅰ和XhoⅠ內(nèi)切酶之間，空載體pEGFP-C1含有

4、Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)，可以作為Hpa cDNA片段的反向克隆載體使用。分別酶切回收Hpac DNA片段和線性化的空載體，二者進(jìn)行連接反應(yīng)合成反義Hpa cDNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ASHpa。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hpa高表達(dá)的人肺巨細(xì)胞癌PG細(xì)胞系的高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞亞系BE1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行，含600μg/m1G418的RPIM 1640篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染的BE1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pEGF

5、P-C1的細(xì)胞(稱為BE1-Em)作為對(duì)照。 RT-PCR和Westem blot挑選BE1細(xì)胞經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-ASHpa質(zhì)粒后的Hpa低表達(dá)細(xì)胞克隆，稱此為BE1-ASHpa細(xì)胞。 免疫熒光：觀察轉(zhuǎn)染前后Hpa蛋白變化。分別將轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4％多聚甲醛室溫固定15min后，TritonX-100處理，血清封閉后，滴加Hpa一抗，4℃孵育過夜。避光加羅丹明(TRITC)標(biāo)記二抗，D

6、API復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察。 細(xì)胞計(jì)數(shù)法：0.5×10<'4>/孔的細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，連續(xù)6天分別計(jì)數(shù)各組細(xì)胞總數(shù)，觀察轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的生長情況。 MTT比色法：1×10<'4>/孔的細(xì)胞數(shù)分別接種轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，酶標(biāo)儀機(jī)檢前加入MTT培養(yǎng)細(xì)胞4h，DMSO溶解沉淀顆粒，連續(xù)4天檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。流式細(xì)胞術(shù)：分別收集轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞，95％乙醇固定

7、，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×10<'6>/ml，PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化，Modfit LT V3.0軟件分析結(jié)果。 細(xì)胞體外侵襲能力與運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)(Transwell小室法)：接種各組細(xì)胞分別至Matrigel包被和未包被的含有微孔濾膜的Transwell小室，37℃、5％CO<,2>分別培養(yǎng)24h和10h后，甲醇室溫固定10min，蘇木素染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞體外侵襲能力和運(yùn)動(dòng)能力的改變情況。 We

8、stern blot：步驟同上，所用一抗為VEGF、VEGF-C、pAkt和Akt的一抗。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各指標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 3、使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、Hpa在三種不同轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在一定差別。細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫化學(xué)染色可見：三種肺癌細(xì)胞中均有Hpa蛋白表達(dá)，位于胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒為陽性信號(hào)，但是在不

9、同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系中其表達(dá)水平存在一定差別：人肺巨細(xì)胞癌PG的高轉(zhuǎn)移亞系細(xì)胞BE1中的染色強(qiáng)于其它兩種細(xì)胞系。Westem blot結(jié)果顯示BE1細(xì)胞中Hpa蛋白表達(dá)量(0.993±0.029)約為LH7細(xì)胞(0.529±0.011)的1.8倍(P=0.002)，A2細(xì)胞(0.599±0.017)的1.7倍(P=0.007)。Hpa mRNA檢測(cè)表明，LH7細(xì)胞的表達(dá)量(0.356±0.017)和A2細(xì)胞的表達(dá)量(0.360±0.011

10、)低于BE1細(xì)胞(0.600±0.014)(P=0.002，P=0.005)。 2、帶有Hpa cDNA片段的peDNA3質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，回收Hpa片段，pEGFP-C1載體用相同雙酶切線性化處理后與Hpa片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化后，得到Hpa反義cDNA表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ASHpa。Hpa高表達(dá)肺癌細(xì)胞系BE1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hpa反義cDNA質(zhì)粒pEGFP-C1-ASHpa后，經(jīng)過篩選得到H

11、pa表達(dá)受到明顯抑制的細(xì)胞BE1-ASHpa，其mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.211±0.009，0.539±0.012)與BE1細(xì)胞(0.496±0013，1.277±0.017)相比，分別下降57.5％和57.8％。 3、BE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-ASHpa后，細(xì)胞的增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡率增加。細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法檢測(cè)結(jié)果表明BE1-ASHpa細(xì)胞的增殖能力低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BE1-A

12、SHpa細(xì)胞的凋亡率增加，為7.72±0.11％，與BE1細(xì)胞相比(0.02±001％)，差異有顯著性(P=0.000)。同時(shí)，G<,1>期細(xì)胞數(shù)百分比增加，為63.27±2.06％，S、G<,2>期細(xì)胞數(shù)百分比減少為36.73±2.06％，與BE1細(xì)胞相比(41.28±0.98％，58.71±0.98％)，差異有顯著性(P=0.006)。 4、BE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-ASHpa后，細(xì)胞的體外侵襲能力和運(yùn)動(dòng)能力減弱。Tr

13、answelL小室檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲和運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BE1-ASHpa細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力都明顯降低，侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)為12.00±1.41，運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)為20.67±1.63，與BE1細(xì)胞相比(49.71±3.48，62.83±3.60)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000)。 5、BE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-ASHpa后，隨Hpa的表達(dá)下降，細(xì)胞的pAkt、VEGF和VEGF-C的表達(dá)減弱，而Akt

14、的表達(dá)水平無變化。pAkt、VEGF和VEGF-C在BE1-ASHpa細(xì)胞中的表達(dá)量均低于BE1細(xì)胞和BE1-Em細(xì)胞，差異有顯著性(P<0.01)，而三者的Akt表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。 研究結(jié)論： 1、在所檢測(cè)的肺癌細(xì)胞系中Hpa均有表達(dá)，且其在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。 2、反義Hpa cDNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ASHpa構(gòu)建成功，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hpa高表達(dá)肺癌細(xì)胞后，