miR-195在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞的增殖與腫瘤的生長(zhǎng)密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力決定了其轉(zhuǎn)移能力。為進(jìn)一步明確miR-195對(duì)子宮頸癌發(fā)病的抑制作用，本學(xué)位論文在體外培養(yǎng)的子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)中表達(dá)miR-195，檢測(cè)miR-195對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。在確定miR-195能抑制HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的基礎(chǔ)上，本學(xué)位論文第三部分深入研究了miR-195發(fā)揮作用的分子機(jī)制，篩選并鑒

2、定了細(xì)胞周期蛋白D2(CyclinD2，CCND2)和轉(zhuǎn)錄因子MYB為miR-195直接調(diào)控的靶基因。
　　研究表明，CCND2異常表達(dá)與人腦組織膠質(zhì)瘤、胃痛等多種腫瘤的發(fā)生具有密切相關(guān)性。MYB是廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而在細(xì)胞的分化與增殖過程中起到重要作用。MYB在神經(jīng)母細(xì)胞瘤及乳腺癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且其表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)。此外還有研究表明，MYB蛋白和腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?？梢姡珻

3、CND2和MYB是兩個(gè)重要的促腫瘤蛋白。我們第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-195可作用于CCND2及MYB基因的3'-UTR而直接抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，該結(jié)果初步闡明了miR-195抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的分子機(jī)制。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
　　第一部分 miR-195在子宮頸癌組織中的表達(dá)研究
　　目的:
　　檢測(cè)子宮頸癌組織及癌旁組織中miR-195的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料分析m

4、iR-195與子宮頸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法:
　　在本部分研究中，我們首先收集69對(duì)子宮頸癌的臨床樣本，并提取子宮頸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織的RNA，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)miR-195表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，明確miR-195在子宮頸癌組織及鄰近癌旁組織中的表達(dá)情況。最后，分析miR-195表達(dá)與子宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性;進(jìn)一步結(jié)合臨床病理資料分析miR-195表達(dá)與子宮頸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　

5、1.相對(duì)于癌旁組織，miR-195在子宮頸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示差異具有顯著性。
　　2.與沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本（38例）相比，miR-195在發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本（31例）中表達(dá)顯著下調(diào)（降為0.43倍）。
　　3.在沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮頸癌病例中，18例(47％)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織降低，8例(21％)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織未發(fā)生改變，12例(32％

6、)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織升高。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，20例(65％)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織降低，6例(19％)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織未發(fā)生改變，5例(16％)腫瘤組織中miR-195表達(dá)水平較癌旁組織升高。
　　結(jié)論:
　　1.相對(duì)于癌旁組織，miR-195在子宮頸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，說明miR-195在子宮頸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。
　　2.相

7、對(duì)于未發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮頸痛樣本，miR-195在發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本中表達(dá)顯著下調(diào)，說明miR-195在子宮頸癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分 miR-195對(duì)子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)增殖、遷移及侵襲能力的影響
　　目的:
　　體外絀胞模型研究miR-195對(duì)子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)增殖、遷移、侵襲能力的影響。
　　方法:
　　在本部分研究中，我們?cè)贖eLa細(xì)胞中高表達(dá)miR-1

8、95，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，從而明確miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa細(xì)胞中表達(dá)miR-195后細(xì)胞周期的改變，從而明確miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響。利用傷口愈合模型來研究miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。利用基于Matrigel的Transwell法研究miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響
　　第

9、5天假轉(zhuǎn)染組(Mock)細(xì)胞數(shù)為(14.5±2.1)×105;對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為(14.6±0.8)×105;而表達(dá)miR-195組細(xì)胞數(shù)為(10.4±1.0)×105，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與Mock組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照RNA對(duì)活力細(xì)胞數(shù)無影響（0.97±0.11倍），而高表達(dá)miR-195組細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照組比較顯著降低（0.69±0.08倍），兩者比較差異有顯著性(P＜0.05)。
　　2.

10、miR-195對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響
　　Mock組中處于G0/G1期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的50％，S期細(xì)胞約占39％; G2/M期細(xì)胞約占11％;對(duì)照組中處于G0/G1期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的49％，S期細(xì)胞約占41％; G2/M期細(xì)胞約占10％;高表達(dá)miR-195后，處于G0/G1期的細(xì)胞比例增加(60％);處于S期的細(xì)胞比例減少(30％)。三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，表達(dá)miR-195組G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增加(P＜0.0

11、5)，而S期細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著減少(P＜0.05)。
　　3.miR-195對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞傷口愈合能力的影響
　　與對(duì)照組相比，高表達(dá)miR-195的HeLa細(xì)胞傷口愈合能力顯著下降。
　　4.miR-195對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響
　　細(xì)胞接種24小時(shí)后，miR-195高表達(dá)組遷移穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，miR-195高表達(dá)組遷移穿過Matrigel

12、的細(xì)胞染色吸光值為對(duì)照組的0.69±0.06倍(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-195在子宮頸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，可抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲。
　　2.miR-195可作為子宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)，為子宮頸癌的治療提供新的思路。
　　第三部分 miR-195功能靶基因CCND2和MYB的鑒定
　　目的:
　　預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-195在HeLa細(xì)胞中的靶向基因，從而明

13、確miR-195調(diào)控子宮頸癌細(xì)胞行為的作用機(jī)制。
　　方法:
　　本部分研究中，我們選擇較為權(quán)威的生物信息學(xué)工具TargetScan、DIANAmicroT和PicTar對(duì)miR-195的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到一批共同預(yù)測(cè)到的靶基因。經(jīng)過功能注釋以及文獻(xiàn)檢索，最終將目標(biāo)鎖定在CCND2和MYB兩個(gè)基因上。進(jìn)一步利用定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法來驗(yàn)證miR-195對(duì)CCND2和MYB表達(dá)的調(diào)控作用;并將包含有miR-195結(jié)

14、合區(qū)的CCND2和MYB基因的3'-UTR序列構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中，然后將該質(zhì)粒與miR-195共同轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。最后，在高表達(dá)miR-195的細(xì)胞中同補(bǔ)CCND2和MYB，檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及功能注釋和文獻(xiàn)檢索，最終將目標(biāo)鎖定在CCND2和MYB兩個(gè)基因上。其中CCND2與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而MYB與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲有密切相關(guān)性。

15、>　　2.定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)miR-195后，CCND2基因的mRNA水平下降至對(duì)照組的0.85±0.07倍（P＜0.05），MYB基因的mRNA水平下降至對(duì)照組的0.79±0.06倍(P＜0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，高表達(dá)miR-195后CCND2和MYB的蛋白水平也顯著降低。以上結(jié)果表明，miR-195在HeLa細(xì)胞中抑制CCND2和MYB基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，含CCN

16、D2基因3'-UTR的報(bào)告系統(tǒng)中，高表達(dá)miR-195組熒光素酶活性降低為對(duì)照組的0.65±0.07倍(P＜0.05);含MYB基因3'-UTR的報(bào)告系統(tǒng)中，高表達(dá)miR-195組熒光素酶活性降低為對(duì)照組的0.53±0.08倍(P＜0.05)。
　　3.在高表達(dá)miR-195的細(xì)胞中回補(bǔ)CCND2可以使細(xì)胞增殖能力回復(fù)到對(duì)照組的0.85±0.07倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對(duì)照組的0.65±0.07倍）相比差異有顯著性，回補(bǔ)CC

17、ND2對(duì)miR-195抑制的細(xì)胞遷移、侵襲能力無影響。
　　4.在高表達(dá)miR-195的細(xì)胞中回補(bǔ)MYB可以使細(xì)胞增殖能力回復(fù)到對(duì)照組的0.77±0.05倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對(duì)照組的0.65±0.07倍）相比差異有顯著性;回補(bǔ)MYB使miR-195抑制的細(xì)胞遷移得以部分回復(fù);回補(bǔ)MYB可以將被miR-195抑制的細(xì)胞侵襲能力回復(fù)到對(duì)照組的0.86±0.07倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對(duì)照組的0.69±0.05倍）相比差