miR-195在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制研究.pdf

1、腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移是子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細胞的增殖與腫瘤的生長密切相關，而腫瘤細胞的侵襲、遷移能力決定了其轉(zhuǎn)移能力。為進一步明確miR-195對子宮頸癌發(fā)病的抑制作用，本學位論文在體外培養(yǎng)的子宮頸癌細胞(HeLa)中表達miR-195，檢測miR-195對細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。在確定miR-195能抑制HeLa細胞增殖、侵襲及遷移能力的基礎上，本學位論文第三部分深入研究了miR-195發(fā)揮作用的分子機制，篩選并鑒

2、定了細胞周期蛋白D2(CyclinD2，CCND2)和轉(zhuǎn)錄因子MYB為miR-195直接調(diào)控的靶基因。
　　研究表明，CCND2異常表達與人腦組織膠質(zhì)瘤、胃痛等多種腫瘤的發(fā)生具有密切相關性。MYB是廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過調(diào)節(jié)基因表達從而在細胞的分化與增殖過程中起到重要作用。MYB在神經(jīng)母細胞瘤及乳腺癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且其表達水平與預后密切相關。此外還有研究表明，MYB蛋白和腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關?？梢姡珻

3、CND2和MYB是兩個重要的促腫瘤蛋白。我們第三部分實驗結果顯示，miR-195可作用于CCND2及MYB基因的3'-UTR而直接抑制蛋白質(zhì)表達，該結果初步闡明了miR-195抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、侵襲及遷移的分子機制。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 miR-195在子宮頸癌組織中的表達研究
　　目的:
　　檢測子宮頸癌組織及癌旁組織中miR-195的表達情況，并結合臨床病理資料分析m

4、iR-195與子宮頸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的關系。
　　方法:
　　在本部分研究中，我們首先收集69對子宮頸癌的臨床樣本，并提取子宮頸癌組織和對應癌旁組織的RNA，然后利用實時熒光定量PCR技術對miR-195表達水平進行檢測，明確miR-195在子宮頸癌組織及鄰近癌旁組織中的表達情況。最后，分析miR-195表達與子宮頸癌發(fā)病的相關性;進一步結合臨床病理資料分析miR-195表達與子宮頸癌轉(zhuǎn)移的相關性。
　　結果:
　　

5、1.相對于癌旁組織，miR-195在子宮頸癌組織中的表達明顯下調(diào)，統(tǒng)計分析結果顯示差異具有顯著性。
　　2.與沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本（38例）相比，miR-195在發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本（31例）中表達顯著下調(diào)（降為0.43倍）。
　　3.在沒有發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的子宮頸癌病例中，18例(47％)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織降低，8例(21％)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織未發(fā)生改變，12例(32％

6、)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織升高。在發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的病例中，20例(65％)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織降低，6例(19％)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織未發(fā)生改變，5例(16％)腫瘤組織中miR-195表達水平較癌旁組織升高。
　　結論:
　　1.相對于癌旁組織，miR-195在子宮頸癌組織中的表達明顯下調(diào)，說明miR-195在子宮頸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。
　　2.相

7、對于未發(fā)生盆腔淋巴結轉(zhuǎn)移的子宮頸痛樣本，miR-195在發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌樣本中表達顯著下調(diào)，說明miR-195在子宮頸癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分 miR-195對子宮頸癌細胞(HeLa)增殖、遷移及侵襲能力的影響
　　目的:
　　體外絀胞模型研究miR-195對子宮頸癌細胞(HeLa)增殖、遷移、侵襲能力的影響。
　　方法:
　　在本部分研究中，我們在HeLa細胞中高表達miR-1

8、95，通過對細胞進行直接計數(shù)，從而明確miR-195對HeLa細胞增殖的影響。利用流式細胞術檢測HeLa細胞中表達miR-195后細胞周期的改變，從而明確miR-195對HeLa細胞周期的影響。利用傷口愈合模型來研究miR-195對HeLa細胞遷移能力的影響。利用基于Matrigel的Transwell法研究miR-195對HeLa細胞侵襲能力的影響。
　　結果:
　　1.miR-195對HeLa細胞增殖的影響
　　第

9、5天假轉(zhuǎn)染組(Mock)細胞數(shù)為(14.5±2.1)×105;對照組細胞數(shù)為(14.6±0.8)×105;而表達miR-195組細胞數(shù)為(10.4±1.0)×105，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。CCK-8檢測結果顯示，與Mock組相比，轉(zhuǎn)染對照RNA對活力細胞數(shù)無影響（0.97±0.11倍），而高表達miR-195組細胞生長較對照組比較顯著降低（0.69±0.08倍），兩者比較差異有顯著性(P＜0.05)。
　　2.

10、miR-195對HeLa細胞周期的影響
　　Mock組中處于G0/G1期的細胞占總細胞數(shù)的50％，S期細胞約占39％; G2/M期細胞約占11％;對照組中處于G0/G1期的細胞占總細胞數(shù)的49％，S期細胞約占41％; G2/M期細胞約占10％;高表達miR-195后，處于G0/G1期的細胞比例增加(60％);處于S期的細胞比例減少(30％)。三次實驗結果統(tǒng)計顯示，表達miR-195組G0/G1期細胞比例較對照組顯著增加(P＜0.0

11、5)，而S期細胞比例較對照組顯著減少(P＜0.05)。
　　3.miR-195對子宮頸癌HeLa細胞傷口愈合能力的影響
　　與對照組相比，高表達miR-195的HeLa細胞傷口愈合能力顯著下降。
　　4.miR-195對子宮頸癌HeLa細胞侵襲能力的影響
　　細胞接種24小時后，miR-195高表達組遷移穿過Matrigel的細胞數(shù)明顯少于對照組;結晶紫染色結果顯示，miR-195高表達組遷移穿過Matrigel

12、的細胞染色吸光值為對照組的0.69±0.06倍(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.miR-195在子宮頸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，可抑制HeLa細胞生長、增殖、遷移和侵襲。
　　2.miR-195可作為子宮頸癌治療的潛在靶點，為子宮頸癌的治療提供新的思路。
　　第三部分 miR-195功能靶基因CCND2和MYB的鑒定
　　目的:
　　預測并驗證miR-195在HeLa細胞中的靶向基因，從而明

13、確miR-195調(diào)控子宮頸癌細胞行為的作用機制。
　　方法:
　　本部分研究中，我們選擇較為權威的生物信息學工具TargetScan、DIANAmicroT和PicTar對miR-195的靶基因進行預測，得到一批共同預測到的靶基因。經(jīng)過功能注釋以及文獻檢索，最終將目標鎖定在CCND2和MYB兩個基因上。進一步利用定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法來驗證miR-195對CCND2和MYB表達的調(diào)控作用;并將包含有miR-195結

14、合區(qū)的CCND2和MYB基因的3'-UTR序列構建到熒光素酶報告質(zhì)粒中，然后將該質(zhì)粒與miR-195共同轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中進行雙熒光素酶活性檢測。最后，在高表達miR-195的細胞中同補CCND2和MYB，檢測細胞增殖、遷移及侵襲能力。
　　結果:
　　1.經(jīng)過生物信息學預測及功能注釋和文獻檢索，最終將目標鎖定在CCND2和MYB兩個基因上。其中CCND2與細胞周期密切相關，而MYB與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲有密切相關性。

15、>　　2.定量PCR實驗結果顯示，在HeLa細胞中高表達miR-195后，CCND2基因的mRNA水平下降至對照組的0.85±0.07倍（P＜0.05），MYB基因的mRNA水平下降至對照組的0.79±0.06倍(P＜0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡結果顯示，高表達miR-195后CCND2和MYB的蛋白水平也顯著降低。以上結果表明，miR-195在HeLa細胞中抑制CCND2和MYB基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達。熒光素酶檢測結果顯示，含CCN

16、D2基因3'-UTR的報告系統(tǒng)中，高表達miR-195組熒光素酶活性降低為對照組的0.65±0.07倍(P＜0.05);含MYB基因3'-UTR的報告系統(tǒng)中，高表達miR-195組熒光素酶活性降低為對照組的0.53±0.08倍(P＜0.05)。
　　3.在高表達miR-195的細胞中回補CCND2可以使細胞增殖能力回復到對照組的0.85±0.07倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對照組的0.65±0.07倍）相比差異有顯著性，回補CC

17、ND2對miR-195抑制的細胞遷移、侵襲能力無影響。
　　4.在高表達miR-195的細胞中回補MYB可以使細胞增殖能力回復到對照組的0.77±0.05倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對照組的0.65±0.07倍）相比差異有顯著性;回補MYB使miR-195抑制的細胞遷移得以部分回復;回補MYB可以將被miR-195抑制的細胞侵襲能力回復到對照組的0.86±0.07倍，與轉(zhuǎn)染miR-195組（為對照組的0.69±0.05倍）相比差