MiR-376a在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、MicroRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的,存在于動植物以及病毒中的長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA,miRNA主要通過與靶標基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的完全或不完全配對,降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯,從而廣泛參與調控個體生長發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動。越來越多的證據(jù)表明,miRNA的表達紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。肝癌是發(fā)病率和致死率都很高的惡性腫瘤之一,5年生存率不到40%,嚴重危害人們的生命和健康。因此,

2、揭示肝癌發(fā)生發(fā)展分子機制的研究對于有效地預防肝癌,提高肝癌的治療效果有重要意義。近幾年科學家發(fā)現(xiàn)了許多在HCC中起重要作用的microRNA并闡述了其作用機制,比如miR-221,miR-222,miR-21,miR-122等以及許多與腫瘤分化,腫瘤轉移和預后等臨床指征相關microRNA,豐富了肝癌發(fā)病機制的理論認識。
   人和動物的肝臟都具有極強的調節(jié)自身生長和大小的能力,肝切除后肝臟即進入增殖狀態(tài),引起一系列肝再生因子水

3、平的變化,比如:肝細胞生長因子(HGFHepatocyteGrowthFactor),這些因子一方面使肝再生精確、有序地進行,另一方面也有可能影響腫瘤細胞所處的環(huán)境,導致腫瘤的復發(fā)。因此,肝再生和肝癌之間有著非常密切的聯(lián)系。本研究組用microRNA芯片篩選小鼠肝再生早期發(fā)生變化的microRNA時,篩選到Mmu-miR-376b在肝再生早期表達是下調的,又因為肝再生早期與肝癌發(fā)生過程中有許多共有的調節(jié)因子,因此我們試想miR-376在

4、肝癌中的表達是否發(fā)生異常,而miR-376的異常表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展又有怎樣的關系。Hsa-miR-376b與Hsa-miR-376a之間有很強的同源性,因此我檢測了miR-376a和miR-376b在肝癌組織中的表達變化,并發(fā)現(xiàn)miR-376a在肝癌組織中的變化較miR-376b明顯,因此我們以miR-376a為研究對象,研究其在肝癌中的作用機制。
   目前已經(jīng)有幾篇文章報道了miR-376在人肝內(nèi)膽管癌,上皮卵巢癌等腫瘤中

5、表達是下調的,而對于miR-376功能的研究尚知之甚少,并且miR-376在肝細胞癌中的作用及其機制研究未見諸報道。本論文針對miR-376a研究其在肝癌組織中的表達規(guī)律并進一步探討其功能及分子機制,為更好地闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并探索肝癌潛在的治療靶點提供實驗依據(jù)。
   一、miR-376a在肝癌組織中的表達及其生物學功能的研究
   我們在肝癌標本中檢測了miR-376b和miR-376a的表達水平,發(fā)現(xiàn)miR

6、-376a的表達變化趨勢更明顯,在大多數(shù)癌組織中的表達低于其癌旁組織,說明miR-376a表達水平的降低是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個高頻事件。因此,本文以miR-376a為研究對象研究其生物學功能以及臨床意義。通過對miR-376a在肝癌組織及癌旁組織中的的表達變化與臨床指征進行關聯(lián),卡方檢驗結果提示,miR-376a的表達變化與血清甲胎蛋白的水平有關,即血清中甲胎蛋白高的患者其癌組織中的miR-376a的表達水平也較高,由于甲胎蛋白是肝

7、癌診斷的標志物,提示miR-376a可能輔助甲胎蛋白作為肝癌診斷潛在的標志物。
   為了明確miR-376a在肝癌發(fā)生中的生物學功能,我們用miR-376amimics處理肝癌細胞系(Huh7和HepG2),通過MTT實驗檢測其細胞的增殖能力,通過AV-FITC/PI染色后流式細胞術檢測其細胞凋亡率,并將miR-376基因克隆進pcDNA3.1質粒中,并篩選了穩(wěn)定表達maR-376的Huh7細胞株,并以該細胞株荷瘤裸鼠,檢測裸

8、鼠的成瘤率。結果顯示,miR-376a抑制了細胞增殖,促進了細胞凋亡,并且抑制了Huh7細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率。
   二、miR-376a下游調控機制的研究
   為了探討miR-376a的抑癌機制,我們通過Targetscan軟件預測了miR-376a的候選靶基因,得到了大約220個候選靶基因。為了從中篩選到起關鍵作用的靶基因,我們進一步用博奧公司的MAS軟件對候選靶基因進行了信號通路分析以及GO功能分析,Pathw

9、ay分析結果顯示,候選靶基因相互作用構成了一個復雜的相互作用網(wǎng)絡,而PIK3R1處于這個網(wǎng)絡的節(jié)點位置,即Hub基因。文獻提示,Hub基因對于維持網(wǎng)絡的穩(wěn)定起著關鍵的作用,并且越來越多的研究表明,microRNA傾向于調控Hub基因。而qRT-PCR和WesternBlotting實驗結果顯示,miR-376a降低了PIK3R1的表達水平。并且,熒光素酶報告基因實驗證實,PIK3R1是受miR-376a直接調控的靶基因。另外,我們通過W

10、B的方法檢測了肝癌組織中p85α(PIK3R1)的表達,發(fā)現(xiàn)p85α在肝癌組織中是表達上調的,與miR-376a的表達趨勢是相反的,并且我們做了統(tǒng)計分析,兩者存在負相關趨勢,說明肝癌組織中p85α的表達上調與miR-376a的表達下調有關。
   為了探討PIK3R1的生物學功能,我們通過RNAi和過表達的方法處理Huh7細胞,然后通過MTT實驗和AV-FITC/PI染色的方法分別檢測了細胞增殖的變化和細胞凋亡的變化。結果顯示H

11、uh7細胞中的PIK3R1被有效干擾后,細胞增殖率降低,細胞凋亡率升高,而PIK3R1過表達后,細胞凋亡率降低。說明PIK3R1是抑制細胞凋亡,促進細胞增殖的作用。這與文獻報道的是一致的。另有文獻報道,miR-29可以通過靶向抑制PIK3R1而激活p53的表達,那么我們猜想miR-376a既然可以靶向抑制PIK3R1的表達,那么p53的表達水平是否變化了呢,我們發(fā)現(xiàn)miR-376amimics處理Huh7細胞后p53表達升高了,并且Hu

12、h7細胞中PIK3R1被干擾后,p53表達也升高了。因此,我們推測,miR-376a可通過抑制PIK3R1的表達而激活p53的表達。
   三、miR-376a上游表達調控機制的研究
   有文獻提示,在人上皮卵巢癌細胞系(EOC)中miR-376a所在基因簇的表達水平受表觀遺傳修飾的調節(jié)。為了探討肝細胞中miR-376a基因簇是否受表觀遺傳修飾的控制,我們用DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙?;敢种苿?/p>

13、PBA處理大鼠正常肝細胞BRL-3A和Huh7細胞。結果顯示,與對照組相比,這兩個細胞株中的miR-376a表達都升高了,說明是表觀遺傳修飾的變化激活了miR-376a的表達。另有報道稱microRNA與表觀遺傳修飾相互影響共同參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,那么在miR-376a的候選靶基因中是否有與表觀遺傳相關的基因呢,通過MAS軟件對靶基因進行GO分析,發(fā)現(xiàn)了HDAC9這個靶基因,隨即我們通過RT-PCR和WB驗證,證實了HDAC9是受miR

14、-376a調控的靶基因。已知HDAC9抑制MEF2介導的基因轉錄,且有文獻證實MEF2是調控miR-376a所在基因簇的轉錄因子。因此我們分別將HDAC9和MEF2干擾掉,再檢測miR-376a的表達,結果顯示HDAC9被干擾后miR-376a的表達上調了,說明HDAC9是抑制miR-376a表達的;而MEF2被干擾后,miR-376a表達下調了,說明MEF2正向調控miR-376a的表達。以上結果表明,miR-376a的表達受表觀遺傳

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