NCAPH在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景:
　　宮頸癌是全球最常見的婦科腫瘤之一，人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)的持續(xù)感染是其首要啟動(dòng)因素。HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其編碼的早期蛋白E6、E7是導(dǎo)致宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白。然而，僅有HPV的感染不能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，它僅作為宮頸致癌過程的第一次打擊。HPV感染宮頸上皮后所誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞內(nèi)一系列的分子信號通路的改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。然而，目前HPV致宮頸癌發(fā)生發(fā)展

2、的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體的非染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白的亞單位H(Non-SMCCondensinⅠ Complex Subunit H，NCAPH)基因，主要參與間期核染色質(zhì)轉(zhuǎn)變成高度螺旋的核染色體，以往有研究顯示:NCAPH與非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后有關(guān)，這提示NCAPH可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但機(jī)制不明。
　　目的:
　　本課題擬通過體外實(shí)驗(yàn)初步闡明NCAPH在宮頸癌中的表達(dá)情況、對宮頸癌細(xì)胞生長的影響及其可能

3、機(jī)制，初步揭示HPV E7與NCAPH之間的調(diào)控關(guān)系。
　　方法:
　　1）收集10例正常宮頸及22例宮頸癌的新鮮組織標(biāo)本，提取組織內(nèi)的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同法提取三種宮頸癌細(xì)胞系中的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測NCAPH的表達(dá)，對比其在正常宮頸及宮頸癌中的表達(dá)差異。收集65例正常宮頸組織及149例宮頸癌的石蠟標(biāo)本，免疫組織化學(xué)方法檢測其中NCAPH蛋白的表達(dá)，對比正常宮頸及宮頸癌中NCAPH

4、蛋白的表達(dá)差異;
　　2）培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向NCAPH siRNA，利用CCK-8試劑盒、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測NCAPH對細(xì)胞增殖的影響;利用transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測NCAPH對細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響;
　　3）培養(yǎng)HeLa和SiHa，轉(zhuǎn)染NCAPH siRNA，利用Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)變化;
　　4）利用JASPAR及PROMO軟

5、件預(yù)測NCAPH啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子，挑選評分最高的轉(zhuǎn)錄因子E2F1;在HeLa和SiHa中干擾和過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F1，檢測NCAPH的mRNA和蛋白表達(dá)變化;
　　5）將NCAPH基因啟動(dòng)子區(qū)序列連接到pGL3-Basic載體上，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子E2F1的過表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子E2F1是否可以結(jié)合NCAPH啟動(dòng)子區(qū)，激活NCAPH基因的轉(zhuǎn)錄;
　　6）培養(yǎng)HPV16E7高表達(dá)

6、的細(xì)胞系RPE1 E7及其對照細(xì)胞系RPE1，檢測E7過表達(dá)對NCAPH及轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)的影響;在HeLa和SiHa中干擾E7，檢測NCAPH及轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)變化;在RPE1 E7細(xì)胞中干擾轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，檢測敲低E2F1能否影響E7對NCAPH表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1)NCAPH在3種宮頸癌細(xì)胞系中均有表達(dá);與正常宮頸組織相比，NCAPH在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著升高;
　　2）CC

7、K-8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾宮頸癌細(xì)胞中NCAPH的表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯下降，克隆形成能力顯著降低;
　　3）干擾宮頸癌細(xì)胞中NCAPH的表達(dá)后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制，上皮相關(guān)的蛋白ZO-1表達(dá)水平顯著升高，而間葉相關(guān)的蛋白表達(dá)水平Vimentin、Snail顯著下降;
　　4）干擾宮頸癌細(xì)胞中NCAPH的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的總AKT沒有明顯變化，而絲氨酸473位點(diǎn)磷酸化的AKT蛋白的表達(dá)顯著降低;<