NCAPH在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的初步研究.pdf

1、背景:
　　宮頸癌是全球最常見的婦科腫瘤之一，人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)的持續(xù)感染是其首要啟動因素。HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其編碼的早期蛋白E6、E7是導致宮頸細胞惡性轉化的關鍵蛋白。然而，僅有HPV的感染不能導致細胞的惡性轉化，它僅作為宮頸致癌過程的第一次打擊。HPV感染宮頸上皮后所誘導的宿主細胞內一系列的分子信號通路的改變，最終導致細胞發(fā)生了惡性轉化。然而，目前HPV致宮頸癌發(fā)生發(fā)展

2、的機制仍有待進一步闡明。凝縮蛋白Ⅰ復合體的非染色體結構維持蛋白的亞單位H(Non-SMCCondensinⅠ Complex Subunit H，NCAPH)基因，主要參與間期核染色質轉變成高度螺旋的核染色體，以往有研究顯示:NCAPH與非小細胞肺癌的不良預后有關，這提示NCAPH可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，但機制不明。
　　目的:
　　本課題擬通過體外實驗初步闡明NCAPH在宮頸癌中的表達情況、對宮頸癌細胞生長的影響及其可能

3、機制，初步揭示HPV E7與NCAPH之間的調控關系。
　　方法:
　　1）收集10例正常宮頸及22例宮頸癌的新鮮組織標本，提取組織內的總RNA并逆轉錄為cDNA，同法提取三種宮頸癌細胞系中的總RNA并逆轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR法檢測NCAPH的表達，對比其在正常宮頸及宮頸癌中的表達差異。收集65例正常宮頸組織及149例宮頸癌的石蠟標本，免疫組織化學方法檢測其中NCAPH蛋白的表達，對比正常宮頸及宮頸癌中NCAPH

4、蛋白的表達差異;
　　2）培養(yǎng)宮頸癌細胞系HeLa和SiHa，瞬時轉染靶向NCAPH siRNA，利用CCK-8試劑盒、平板克隆形成實驗檢測NCAPH對細胞增殖的影響;利用transwell遷移與侵襲實驗檢測NCAPH對細胞遷移與侵襲能力的影響;
　　3）培養(yǎng)HeLa和SiHa，轉染NCAPH siRNA，利用Western Blot和實時熒光定量PCR法檢測相關蛋白的表達變化;
　　4）利用JASPAR及PROMO軟

5、件預測NCAPH啟動子區(qū)的轉錄因子，挑選評分最高的轉錄因子E2F1;在HeLa和SiHa中干擾和過表達轉錄因子E2F1，檢測NCAPH的mRNA和蛋白表達變化;
　　5）將NCAPH基因啟動子區(qū)序列連接到pGL3-Basic載體上，構建轉錄因子E2F1的過表達載體，然后共轉染293T細胞，利用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)驗證轉錄因子E2F1是否可以結合NCAPH啟動子區(qū)，激活NCAPH基因的轉錄;
　　6）培養(yǎng)HPV16E7高表達

6、的細胞系RPE1 E7及其對照細胞系RPE1，檢測E7過表達對NCAPH及轉錄因子E2F1的表達的影響;在HeLa和SiHa中干擾E7，檢測NCAPH及轉錄因子E2F1的表達變化;在RPE1 E7細胞中干擾轉錄因子E2F1的表達，檢測敲低E2F1能否影響E7對NCAPH表達的影響。
　　結果:
　　1)NCAPH在3種宮頸癌細胞系中均有表達;與正常宮頸組織相比，NCAPH在宮頸癌組織中的表達水平顯著升高;
　　2）CC

7、K-8、平板克隆形成實驗結果顯示:干擾宮頸癌細胞中NCAPH的表達后，細胞增殖能力明顯下降，克隆形成能力顯著降低;
　　3）干擾宮頸癌細胞中NCAPH的表達后，細胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制，上皮相關的蛋白ZO-1表達水平顯著升高，而間葉相關的蛋白表達水平Vimentin、Snail顯著下降;
　　4）干擾宮頸癌細胞中NCAPH的表達后，細胞內的總AKT沒有明顯變化，而絲氨酸473位點磷酸化的AKT蛋白的表達顯著降低;<