miR-28-5p在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制.pdf

1、腎細(xì)胞癌(rena cell carcinoma，RCC)是成人腎臟常見腫瘤，在我國泌尿系統(tǒng)腫瘤中位居第三，死亡率高達(dá)40％，且發(fā)病率以2-3％的比率逐年上升。RCC是一種與遺傳、環(huán)境、代謝等相關(guān)的疾病，但發(fā)病機(jī)制至今不詳，且多數(shù)病人對化療藥物不敏感。目前臨床尚無RCC特異診斷標(biāo)志物，一些常用分子標(biāo)志物靈敏性和特異性較低。因此，尋找具有潛在臨床應(yīng)用前景的RCC分子標(biāo)志物，闡明其在RCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，探索新的診治策略，顯得尤為迫切

2、和重要。
　　微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長約19～24個(gè)非編碼單鏈小RNA分子，它們通過與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。許多miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因或癌基因樣的作用。已有研究報(bào)道，一些miRNA在RCC組織和細(xì)胞

3、中異常表達(dá)，并通過影響腎癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等參與RCC的發(fā)生發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-28-5p在RCC患者血清中的表達(dá)水平顯著降低，提示其可作為RCC潛在分子標(biāo)志物-。但是，miR-28-5p在RCC組織中是否異常表達(dá)，是否參與RCC的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。
　　目的:檢測miR-28-5p在RCC組織中的表達(dá)情況，探討其在RCC發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。
　　方法:通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitativ

4、e real-time PCR，qRT-PCR)檢測34對RCC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織、多種人腎癌細(xì)胞及對照細(xì)胞株中miR-28-5p的表達(dá)水平。生物信息學(xué)預(yù)測miR-28-5p的靶基因，熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證其靶向作用。免疫組化和Western Blotting(WB)技術(shù)分別檢測靶基因在腎癌組織和腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)變化。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)對腎癌細(xì)胞株A498和ACHN中miR-28-5p或靶基因的過表達(dá)或抑制。CCK-

5、8法檢測細(xì)胞增殖，傷口愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移。
　　結(jié)果: qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-28-5p在RCC組織的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織(P＜0.05);miR-28-5p在人腎癌細(xì)胞株中A498、ACHN和Caki-1中的表達(dá)量也明顯低于人正常腎細(xì)胞株HK-2（分別為P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01）。生物信息學(xué)預(yù)測顯示RAS家族相關(guān)蛋白1B(RAS related protein1b，R

6、AP1B)是miR-28-5p的可能的靶基因;熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)，在293T細(xì)胞中過表達(dá)miR-28-5p可劑量依賴性地抑制含有RAP1B3'-UTR的熒光素酶報(bào)告基因的熒光素酶活性;而過表達(dá)miR-28-5p突變體則不影響熒光素酶活性，證實(shí)miR-28-5p可直接作用于RAP1B的3'-UTR，RAP1B是miR-28-5p的直接靶基因。對RAP1B的研究發(fā)現(xiàn)，在RCC組織中RAP1B免疫組化陽性反應(yīng)程度明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組

7、織（P＜0.01），且與miR-28-5p的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.748，P=0.02）;在腎癌細(xì)胞系中，與miR-28-5p表達(dá)水平相反，WB分析顯示RAP1B蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.01）。為進(jìn)一步證實(shí)miR-28-5p對RAP1B的負(fù)向調(diào)控作用，在A498和ACHN細(xì)胞中，瞬時(shí)或穩(wěn)定過表達(dá)miR-28-5p后，發(fā)現(xiàn)RAP1B蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.01）;反之，抑制miR-28-5p的表達(dá)后RAP1B蛋白表達(dá)顯著上調(diào)

8、;而RAP1B mRNA水平則無明顯變化，證實(shí)了miR-28-5p對RAP1B的調(diào)控是經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。體外細(xì)胞功能研究顯示，過表達(dá)miR-28-5p可顯著抑制A498和ACHN細(xì)胞的增殖及A498細(xì)胞的遷移;與之相反，抑制miR-28-5p表達(dá)則顯著增強(qiáng)A498和ACHN細(xì)胞的增殖及A498細(xì)胞的遷移，提示miR-28-5p可抑制腎癌細(xì)胞的增殖與遷移，是一種抑癌miRNA。對RAP1B的功能研究顯示，在A498細(xì)胞中干擾RAP1B

9、可有效抑制細(xì)胞的增殖與遷移;而過表達(dá)RAP1B則可導(dǎo)致細(xì)胞增殖與遷移顯著增強(qiáng)，提示RAP1B在RCC中起原癌基因作用。進(jìn)一步功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，在A498細(xì)胞中過表達(dá)RAP1B后，能有效回復(fù)miR-28-5p對細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用，說明miR-28-5p是通過抑制RAP1B的表達(dá)來負(fù)向調(diào)控腎癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。最后，對RAP1B的一些下游靶基因的檢測顯示，過表達(dá)或抑制miR-28-5p可抑制或增強(qiáng)MAPK信號通路相關(guān)蛋白p38和ERK