探究腫瘤相關(guān)基因GIPC2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景:
　　目前在結(jié)直腸癌和惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了GIPC2的外顯子突變，在胃癌中發(fā)現(xiàn)了GIPC2表達(dá)上調(diào)，相反在腎癌、血癌和腎上腺皮質(zhì)瘤GIPC2表達(dá)下調(diào);31例白血病中發(fā)現(xiàn)29例GIPC2的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化。這些結(jié)果都提示GIPC2可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　方法:
　　本研究主要通過構(gòu)建人和大鼠GIPC2翻譯起始位點(diǎn)ATG上游2000bp序列的一系列不同長度截短片段插入到Basic-pGL3多克隆位點(diǎn)的重組質(zhì)粒

2、，轉(zhuǎn)染到HEK293、HEK293T和PC12等細(xì)胞中檢測(cè)不同長度截短片段所表現(xiàn)出來的轉(zhuǎn)錄活性。包括利用1)Vista比對(duì)不同物種GIPC2基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列，得到GIPC2同源序列;2）分別構(gòu)建插入人和大鼠GIPC2翻譯起始位點(diǎn)ATG上游不同長度截短片段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞和大鼠PC12細(xì)胞;3）根據(jù)報(bào)告基因熒光強(qiáng)度推斷人和大鼠GIPC2的核心啟動(dòng)子區(qū);4）將人GIPC2內(nèi)含子區(qū)同源序列置于核心啟動(dòng)子前面，構(gòu)建重

3、組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293T，HT-29和PC12細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性;5）將人Human-40與Human-30之間保守堿基突變和大鼠Rat-S8與Rat-S11之間最保守堿基單核苷酸突變和次保守堿基突變，構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T和PC12細(xì)胞;6）將大鼠Rat-S8、Rat-S11和Rat-S14轉(zhuǎn)染α-KG處理HEK293T和PC12細(xì)胞，檢測(cè)α-KG對(duì)GIPC2的調(diào)控作用;7）提取5'aza處理的HEK293T和PC12細(xì)胞

4、mRNA，Q-PCR檢測(cè)5'aza對(duì)GIPC2的調(diào)控作用。8）體外甲基化人和大鼠GIPC2第一個(gè)外顯子，放在核心啟動(dòng)子前面，構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，檢測(cè)甲基化對(duì)GIPC2第一個(gè)外顯子的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GIPC2在各個(gè)物種中非常保守，哺乳動(dòng)物氨基酸序列和編碼區(qū)序列同源性大于80％;確定了人和大鼠GIPC2核心啟動(dòng)子為+32至+190序列區(qū)域;人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制

5、GIPC2啟動(dòng)子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的同源序列有促進(jìn)啟動(dòng)子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一個(gè)外顯子具有促進(jìn)GIPC2啟動(dòng)子活性的功能，但是甲基化后促進(jìn)啟動(dòng)子活性的功能消失;α-KG可作用于Rat-S8與Rat-S11之間的序列，使得這段序列的抑制啟動(dòng)子功能消失;5'aza處理HEK293T和PC12細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)GIPC2表達(dá)量升高100多倍。
　　結(jié)論:
　　本研究確定了GIPC2的核心啟動(dòng)子區(qū)域。