DYSTROPHIN基因的MLPA檢測(cè)及其相關(guān)基因UTROPHIN的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉疾病，分為DMD(Duchenne muscular dystrophy)和BMD(Becker muscular dystrophy)。均是由于抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因(DYSTROPHIN)突變所致。DMD發(fā)病率為1/3500新生男嬰，是最常見(jiàn)的X—連鎖隱性致死性遺傳病?；純撼錾蟮幕顒?dòng)如抬頭、坐姿等均正常，自1歲以后開始逐漸出現(xiàn)站立和行走困難，首先影響骨盆帶肌肉，以后累及肩胛帶肌肉?；純簞?dòng)作笨拙

2、，易跌倒，走路搖搖晃晃，登樓梯或由坐、臥位起立困難。患兒雙側(cè)腓腸肌逐漸呈假性肥大，腱反射減弱或消失。部分患者表現(xiàn)為行為異常。病變呈進(jìn)行性加重，常到10歲時(shí)已不能行走，大多數(shù)患兒最終臥床不起，并發(fā)痙攣、褥瘡、肺炎而在20歲前死亡。BMD是一種較輕的神經(jīng)肌肉疾病，發(fā)病率約為1/12000，典型的BMD患者首發(fā)癥狀后15—20年仍有行走能力。1/3的DMD和BMD患者有智力減退。此外，很多患者會(huì)有語(yǔ)言障礙，IQ平均值比正常值約低一個(gè)百分點(diǎn)。鑒

3、于本病至今沒(méi)有有效的治療方法，因此高效、準(zhǔn)確的DMD病基因診斷，攜帶者檢測(cè)，產(chǎn)前診斷及正確的遺傳咨詢是預(yù)防本病的關(guān)鍵。Schouten等在多重可擴(kuò)增探針雜交(Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation，MAPH)術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)并設(shè)計(jì)了多重依賴連接探針擴(kuò)增(multiplex ligation—dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)，是利用可與樣本DNA正確雜交并

4、被連接酶連接的探針進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析。MLPA是對(duì)于缺失和重復(fù)突變最有效的檢測(cè)技術(shù)。因此本研究擬用MLPA方法篩查DMD患者，對(duì)缺失和重復(fù)突變的患者和攜帶診斷。 自從法國(guó)醫(yī)學(xué)家Guillaume—Benjanun—Amand Duchenne于1861年首次詳細(xì)描述Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)以來(lái)，不少遺傳學(xué)家對(duì)該病進(jìn)行了系統(tǒng)而深入的研究，近年來(lái)對(duì)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的治療有了新的進(jìn)展，病毒載體介導(dǎo)的基因治

5、療仍處于前沿領(lǐng)域，一些非病毒載體介導(dǎo)的治療方法已經(jīng)應(yīng)用在DMD的動(dòng)物和細(xì)胞模型上。包括質(zhì)粒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，反義鏈介導(dǎo)的外顯子跳躍和寡核苷酸介導(dǎo)的基因編輯。在過(guò)去幾年中，非病毒載體的治療方法已經(jīng)逐漸從實(shí)驗(yàn)室過(guò)度到臨床。有充足的證據(jù)表明由于UTROPHIN與DYSTROPHIN的功能相似，在DMD肌纖維中UTROPHIN可以代替DYSTROPHIN的功能，UTROPHIN與DYSTROPHIN有高度的序列一致性，并且和DYSTROPHI

6、N蛋白復(fù)合物(Dystrophin—associated protein complex，DPC)結(jié)合。而且，在DMD模型鼠中的研究表明，UTROPHIN蛋白水平升高可以減輕DMD的病理癥狀，而且這種作用在轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中都存在。這些都說(shuō)明，外源性的增加DMD肌肉中UTROPHIN的表達(dá)水平似乎可以對(duì)DMD起到治療作用。 方法： 59個(gè)假肥大性營(yíng)養(yǎng)不良癥家系外周血來(lái)自2005年至2007年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院

7、兒科和北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)遺傳系就診的患者及其父母。其中有51例是DMD，8例BMD，他們表型正常的父母，19例羊水穿刺標(biāo)本。診斷標(biāo)準(zhǔn)依賴體格檢查，家族史，肌酸激酶水平，發(fā)病年齡，疾病的進(jìn)展情況等。所有標(biāo)本使用均經(jīng)患者知情并同意。 一、多重PCR檢測(cè)DYSTROPHIN基因12個(gè)外顯子缺失突變 應(yīng)用多重PCR方法檢測(cè)了59例患者DYSTROPHIN基因12個(gè)外顯子缺失突變情況 二、MLPA檢測(cè)DYSTROPHIN基因

8、79個(gè)外顯子拷貝數(shù)改變情況 應(yīng)用MLPA(multiplex ligation—dependent probe amplification)技術(shù)重復(fù)檢測(cè)59例患者的DYSTROPHIN基因79個(gè)外顯子拷貝數(shù)改變情況并明確突變位點(diǎn) 三、統(tǒng)計(jì)分析 比較多重PCR方法與MLPA技術(shù)的優(yōu)越性 四、產(chǎn)前基因診斷 應(yīng)用MLPA和STR連鎖分析技術(shù)對(duì)19例高度懷疑孕有假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥胎兒的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前基因診

9、斷 五、利用相關(guān)文獻(xiàn)及P—MATCH軟件預(yù)測(cè)UTROPHIN基因5’上游序列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn) 獲取UTROPHIN基因5’上游1500bp序列信息(http：//www．Ensembl．Org)，應(yīng)用P—MATCH軟件預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 六、染色質(zhì)免疫沉淀和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 提取Hela細(xì)胞的染色質(zhì)，甲醛交聯(lián)、酶切后應(yīng)用EN1抗體進(jìn)行沉淀，沉淀下來(lái)的染色質(zhì)通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。 Hela細(xì)

10、胞核蛋白和3’生物素標(biāo)記的探針(含有位點(diǎn)2)在凝膠阻滯緩沖液中室溫結(jié)合1小時(shí)，10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。 七、RNA干擾試驗(yàn) 選擇合適的EN1—siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Real time PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞中EN1和UTROPHIN基因mRNA的表達(dá)情況 結(jié)果： 一、多重PCR檢測(cè)DYSTROPHIN基因12個(gè)外顯子缺失 用多重PC

11、R方法在59例假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者中檢測(cè)到30例患者有外顯子缺失。 二、MLPA檢測(cè)DYSTROPHIN基因79個(gè)外顯子拷貝數(shù)改變 MLPA檢測(cè)出33例外顯子缺失，6例外顯子重復(fù)和1例點(diǎn)突變 三、MLPA比多重PCR多檢測(cè)出10例DYSTROPHIN基因突變，兩種方法共同檢測(cè)出的30例突變中MLPA檢測(cè)出16例基因突變范圍比多重PCR大。 四、應(yīng)用MLPA和STR連鎖分析技術(shù)在19例高度懷疑孕有假肥

12、大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥胎兒的孕婦中檢測(cè)出5例男性DMD胎兒，4例女性攜帶者，10例正常胎兒(7例男性，3例女性)。 五、在人類UTROPHIN基因啟動(dòng)子區(qū)域存在2個(gè)EN1的可能結(jié)合位點(diǎn)，分別命名為EN1結(jié)合位點(diǎn)1(—1074～1080)和EN1結(jié)合位點(diǎn)2(—892～—899)。 六、在體外EN1蛋白可以和UTROPHIN基因啟動(dòng)子區(qū)EN1結(jié)合位點(diǎn)2直接結(jié)合。在Hela細(xì)胞中EN1可以和UTROPHIN基因啟動(dòng)子區(qū)EN1結(jié)合位點(diǎn)

13、2直接結(jié)合。 我們應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證在體內(nèi)EN1和UTROPHIN基因上游序列的結(jié)合作用。沉淀的Hela細(xì)胞染色質(zhì)中有EN1結(jié)合位點(diǎn)2的擴(kuò)增，無(wú)對(duì)照位點(diǎn)的擴(kuò)增。 EMSA結(jié)果表明當(dāng)EN1蛋白質(zhì)存在時(shí)出現(xiàn)阻滯的DNA—蛋白質(zhì)復(fù)合體，當(dāng)加入EN1抗體時(shí)出現(xiàn)超阻滯條帶。證明在體外EN1和預(yù)測(cè)的EN1結(jié)合位點(diǎn)2可以直接結(jié)合。 七、EN1—2 siRNA干擾后，EN1表達(dá)下降，UTROPHIN基因表達(dá)升高。