microRNAs調(diào)控FABP1基因表達(dá)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（Human liver fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP1）是一組分子量約為14~15KD，并能與長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合的高保守性蛋白，是脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員之一。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明肝細(xì)胞核因子3β（hepatocyte nuclear factor3β，HNF3β）和CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPα

2、）作用于FABP1基因的啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)，但是3’末端非翻譯區(qū)（3’ untranslational region，3’UTR）的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在深入探討miRNA對(duì)FABP1-3’UTR表達(dá)的影響，從而深入探討肝細(xì)胞脂肪化的機(jī)制，有助于為脂肪肝的診斷治療提供新的診治方向。
　　方法：
　　1.運(yùn)用PicTar、TargetScan等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析 FABP1相關(guān)的miRNAs，篩選出可能靶向FABP1-

3、3’UTR的miRNAs。
　　2.化學(xué)合成FABP1-3’UTR，連接于pmirGLO載體，構(gòu)建重組載體pmirGLO- FABP1-3’UTR，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將軟件預(yù)測(cè)的miRNA mimics或陰性對(duì)照(Negative Control，NC)與pmirGLO-FABP1-3’UTR重組載體分別共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，與對(duì)照組相比，篩選出可能作用于FABP1

4、-3’UTR的miRNAs。
　　3.找到初步篩選出來(lái)的miRNAs與FABP1-3’UTR的配對(duì)堿基，突變配對(duì)堿基，化學(xué)合成pmirGLO-FABP1-3’UTRmuts，由脂質(zhì)體介導(dǎo)與相應(yīng)miRNA mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48h后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，進(jìn)行復(fù)篩。
　　4.進(jìn)一步采用熒光定量PCR和western-blot方法檢測(cè)miRNAs對(duì)FABP1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

5、。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)軟件預(yù)測(cè)及數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選出68條可能靶向FABP1-3’UTR的miRNAs。將以上篩選出miRNA mimics與pmirGLO-FABP1-3’UTR重組載體分別共轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，48h后，與對(duì)照組相比，熒光素酶活性檢測(cè)顯示有16個(gè)miRNAs能明顯降低熒光素酶值(t檢驗(yàn)分析，P<0.05)。且在復(fù)篩中發(fā)現(xiàn)，其中6個(gè)miRNAs相對(duì)應(yīng)的突變體能夠回復(fù)這種下調(diào)作用，即有6個(gè)miRNAs能夠下調(diào)

6、FABP1-3’UTR的表達(dá)，分別為：miR-323a-3p、miR-362-3p、miR-4672、iR-466、miR-3941、miR-4517。以GAPDH為realtime逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明部分miRNAs對(duì)FABP1在mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響甚至上調(diào)，部分下調(diào)FABP1的表達(dá)：miR-323a-