Apelin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及HCM轉(zhuǎn)基因小鼠心肌纖維化的作用研究.pdf

1、第一部分
　　Apelin對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用的研究目的與背景:心肌肥厚可出現(xiàn)于各種心血管疾病的發(fā)展過(guò)程中，如高血壓、心肌缺血、肥厚性心肌病等，可進(jìn)展為心肌纖維化、心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Apelin是一種脂肪因子，與AngⅡ具有同源性，是RAS系統(tǒng)的新成員。Apelin與其G蛋白偶聯(lián)的受體APJ已被證實(shí)可以舒張外周血管，降低血

2、壓，與AngⅡ的生理作用相反。本研究旨在探討apelin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用，以及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)1～3d新生Sprague-Dawley大鼠心肌細(xì)胞，給予血管緊張素Ⅱ刺激。血管緊張素Ⅱ刺激肥大基礎(chǔ)上給予不同濃度apelin。測(cè)定[3H]亮氨酸摻入量、細(xì)胞表面積以及總蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞肥厚程度。激光共聚焦顯微鏡掃描分析細(xì)胞內(nèi)靜息游離鈣水平。免疫印跡法(western blot)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)B型

3、尿鈉肽(Brain natriureticpeptide，BNP)、β肌球蛋白重鏈(Beta myosin heavy chain，β-MHC)、活化T細(xì)胞的核因子3(nuclear factor3 of activated T cells，NFATc3)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)、磷酸化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(phospho-calcineurin)、鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinaseⅡ，CaMKⅡ）

4、、磷酸化鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶Ⅱ(phospho-CaMKⅡ)的蛋白表達(dá)水平。RT-PCR法測(cè)定BNP和β-MHC mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:Apelin可以抑制血管緊張素Ⅱ在體外誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其作用呈劑量依賴(lài)性。Apelin濃度為1000nmol/l時(shí)，其抑制心肌細(xì)胞肥大的作用最強(qiáng)。同時(shí)，apelin可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)靜息游離鈣水平升高，BNP和β-MHC mRNA表達(dá)水平升高，BNP、β-MHC、NFATc

5、3、磷酸化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的蛋白表達(dá)水平升高，均與apelin濃度呈劑量依賴(lài)性。結(jié)論:本研究表明apelin可以抑制AngⅡ在體外誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制與Ca2+依賴(lài)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　第二部分
　　Apelin對(duì)肥厚性心肌病轉(zhuǎn)基因小鼠心肌纖維化的作用研究
　　目的與背景:肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM）是一種遺傳性心血管

6、病，表現(xiàn)為心肌肥厚，心肌纖維化以及心力衰竭，是青年人群中心源性猝死常見(jiàn)的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在HCM心肌肥厚的發(fā)展中起重要作用。血管緊張素受體拮抗劑(ARB)可拮抗HCM心肌纖維化，但療效有限。Apelin是一種脂肪因子，與AngⅡ具有同源性，是RAS系統(tǒng)的新成員。Apelin與其G蛋白偶聯(lián)的受體APJ已被證實(shí)可以增強(qiáng)心肌收縮力及舒張外周?chē)?，與AngⅡ的生理作用相反。本研究旨在

7、探討apelin對(duì)HCM轉(zhuǎn)基因小鼠心肌纖維化的作用，以及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:選取16只成年cTnT-Q92轉(zhuǎn)基因小鼠，分為安慰劑組（生理鹽水）和apelin處理組（0.1umol/kg/天），另取8只非轉(zhuǎn)基因小鼠作為空白對(duì)照組。處理前及處理8周后分別行超聲心動(dòng)圖檢查。8周后取心肌組織切片膠原染色檢測(cè)膠原體積分?jǐn)?shù)(CVF)、心肌細(xì)胞排列。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織collagen1α1，smads2，3，7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因

8、子β1(TGF-β1)的表達(dá)。分別以免疫印跡(Westernblot)法和RT-PCR法檢測(cè)心肌組織collagen1α1，1α2，3α1，TGF-β1和smad2，3，7的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:三組小鼠基礎(chǔ)數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)表明，與安慰劑組比較，apelin處理8周后cTNTQ92轉(zhuǎn)基因小鼠心臟舒張功能明顯改善。組織切片膠原染色表明apelin處理后CVF明顯下降(P＜0.01)，心肌細(xì)胞排列紊

9、亂改善(P＜0.05)。免疫組化分析表明apelin處理轉(zhuǎn)基因小鼠后，與安慰劑組比較，collagen1α1，smads2，3和TGF-β1表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)，而Smad7水平升高(P＜0.01)。Westernblot和RT-PCR分析表明apelin處理8周后，與安慰劑組比較，collagen1α1，collagen1α2，collagen3α1，smads2，3和TGF-β1表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，而Sma