真菌疏水蛋白HGFI、HFBI的表達及其結構、性質和功能研究.pdf

1、真菌疏水蛋白是高等絲狀真菌在特定生理時期分泌產(chǎn)生的一類小分子量蛋白質。經(jīng)研究分析發(fā)現(xiàn)這類蛋白質具有很高的表面活性，能夠通過自組裝在兩相界面處形成兩性蛋白膜，從而改變原介質表面的親/疏水性。根據(jù)水緣性圖譜和自組裝成蛋白膜后溶解度的不同，真菌疏水蛋白被分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。近些年真菌疏水蛋白在國際上得到了廣泛的應用，其中主要包括在蛋白的固定化、分離技術、乳化劑、生物活性包被材料、生物傳感器和生物芯片等領域。但是對真菌疏水蛋白結構方面的研究報道

2、很少，尤其是Ⅰ型疏水蛋白，由于其溶解度小獲得晶體難，所以對其結構及由結構決定的成膜性質和吸附能力了解更少。
　　 根據(jù)計算機模擬及相關實驗分析證實真菌疏水蛋白在固體表面固定化過程中，其N端是懸浮在蛋白表面的，對表面的親/疏水性影響較大;Ⅰ型真菌疏水蛋白中第三個和第四個半胱氨酸之間的氨基酸殘基形成的環(huán)在其自組裝過程中起到了關鍵作用，同時也可能是導致Ⅰ、Ⅱ型真菌疏水蛋白性質差異的主要原因。但這些推測到目前都沒有得到很好的證實。

3、>　　 本研究以灰樹花Ⅰ型疏水蛋白HGFI、瑞氏木霉Ⅱ型疏水蛋白HFBI及其突變體和融合蛋白為研究對象，進行了相關結構、性質與功能的系列研究。
　　 在第二章中，進行了Ⅱ型真菌疏水蛋白HFBI基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達純化與性質研究工作。通過構建畢赤酵母表達載體pPIC9-hfb(I)并將其轉化畢赤酵母細胞，實現(xiàn)了HFBI在畢赤酵母中的成功表達。通過中空纖維膜超濾法和高壓液相色譜法對畢赤酵母表達的HFBI(rHFBI)實

4、現(xiàn)了很好的分離純化。接觸角測定和X-射線光電子能譜實驗表明，重組rHFBI能夠很好地在疏水性的硅化玻璃和親水性的云母表面成膜。水油分散實驗表明，與畢赤酵母表達的真菌Ⅰ型疏水蛋白rHGFI及常用的食品乳化劑酪蛋白酸鈉相比，Ⅱ型真菌疏水蛋白rHFBI具有更好的乳化能力，能更長久地穩(wěn)定油水混合系，使油滴不容易從水溶液中聚集析出，而發(fā)生分層現(xiàn)象。啤酒的gushing實驗表明，與Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI相比，Ⅱ型真菌疏水蛋白rHFBI在溶液中具

5、有更好的穩(wěn)定氣泡的能力，更適合作為啤酒爆瓶的指示劑。
　　 在第三章中，通過蛋白融合技術，將Ⅱ型疏水蛋白HFBI和Ⅰ型疏水蛋白HGFI中第三(C3)、第四(C4)兩個半胱氨酸之間的氨基酸殘基形成的環(huán)(C3-C4環(huán))進行了互換，并將得到的突變體HGFI-AR（HGFI中的C3-C4環(huán)被HFBI中的C3-C4環(huán)所取代）和HFBI-AR（HFBI中的C3-C4環(huán)被HGFI中的C3-C4環(huán)所取代）在畢赤酵母中成功表達。將突變體蛋白進行超

6、濾和高效液相分離純化后，分別利用水接觸角、X-射線光電子能譜、原子力顯微鏡、圓二色譜及ThioflavinT(ThT)和Congored(CR)熒光標記技術對突變蛋白的分子結構與性質進行了表征和分析。結果表明:第一，經(jīng)過大段環(huán)替換以后，突變體蛋白仍保持了疏水蛋白的特性-可以在兩相界面自組裝成兩性蛋白膜進而改變界面的親/疏水性。但由于改變了原有疏水蛋白的親/疏水氨基酸殘基的組成，使得突變體蛋白改變固體表面的親/疏水能力發(fā)生了不同程度變化;

7、第二，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝過程中伴有大量額外的β-片層結構產(chǎn)生，使得其在圓二色譜中的吸收峰向β折疊區(qū)域移動，熒光探針THT吸光值急劇增加以及CR吸收峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象;第三，C3-C4環(huán)在Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI桿狀結構形成過程中都起了至關重要的作用，但它不是rHGFI桿狀結構形成過程中的唯一因素。
　　 在第四章中，通過構建Ⅰ型真菌疏水蛋白HGFI與特異性黏附血管內皮祖細胞(EPC)功能小肽TPS(TPSL

8、EQRTVYAK)的融合表達載體pPIC9-tps-linker-hgf(I)(pPIC9-tlh)，成功的實現(xiàn)了在畢赤酵母中對融合蛋白HGFI-TPS(TLH)的表達。經(jīng)過對融合蛋白TLH進行超濾和高效液相分離純化后，對其相關的生物學活性和功能進行了后續(xù)的測定。
　　 接觸角和X-射線光電子能譜測定實驗表明:TLH保持了真菌疏水蛋白HGFI的兩親性，能夠在疏水的聚已內酯(PCL)表面自組裝成穩(wěn)定的蛋白膜。EPC細胞特異性黏附實

9、驗表明:融合蛋白TLH保持了TPS原有的特異性-能夠很好的發(fā)揮其對血管內皮祖細胞特異性黏附的功能。
　　 在第五章中，通過熒光探針技術，對Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI在不同條件下桿狀結構的形成過程進行了研究。實驗結果表明:第一，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結構的過程是疏水作用力和靜電力共同作用的結果，pH對疏水蛋白rHGFI自組裝成桿狀結構的臨界濃度有很大影響，pH越靠近rHGFI的等電點濃度臨界值越小，越遠離

10、等電點濃度臨界值越大;第二，溶液中不同的溶劑和溶質添加物通過競爭性的降低液體表面張力，從而抑制Ⅰ型疏水蛋白rHGFI桿狀結構的形成過程;第三，與Ⅱ型疏水蛋白HFBI的聚集過程不同，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結構的過程是一個有序的β-片層結構增加的排列過程，而不是一個進行簡單的堆積過程。最后，通過研究溫度對rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結構過程的影響得出了:Ⅰ型疏水蛋白rHGFI桿狀結構的形成過程不是自發(fā)的熵增