替加環(huán)素通過下調(diào)p21抑制黑色素瘤的增殖和轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞，其惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。近些年來，我國惡性黑色素瘤的發(fā)病率迅猛增長，已成為皮膚癌死亡的首要原因。目前治療黑色素瘤最主要的方法是手術(shù)切除,但黑色素瘤起病比較隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。迄今為止，惡性黑色素瘤標(biāo)準(zhǔn)化療效果欠佳，包括手術(shù)在內(nèi)的多種治療方法仍未取得突破性進(jìn)展，因此尋求高效低毒的黑色素瘤治療藥物是目前急需解

2、決的重要問題。近年來，抗生素作為常見藥，因其高效、低毒、價(jià)廉，已成為癌癥治療的新視點(diǎn)。有研究表明，四環(huán)素類抗生素及其衍生物具有抗腫瘤的生物活性。替加環(huán)素是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的第三代甘氨酰環(huán)素類抗生素，其結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類藥物相似，是繼多西環(huán)素、米諾環(huán)素后開發(fā)的新一代抗生素。作為四環(huán)素類似物的替加環(huán)素，現(xiàn)已被用于腫瘤的輔助治療，如急性白血病、前列腺癌及其他腫瘤術(shù)后的治療。近年，已有研究表明替加環(huán)素在惡性血液腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及胃癌中具有明顯抑制

3、腫瘤細(xì)胞增殖的作用，但是對黑色素瘤的效應(yīng)及其作用機(jī)制尚無報(bào)道。本課題以黑色素瘤為主要研究對象，通過體內(nèi)及體外多種實(shí)驗(yàn)手段探討替加環(huán)素抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的效應(yīng)及其具體的分子作用機(jī)理，為替加環(huán)素作為治療惡性黑色素瘤的臨床候選藥物提供更多的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）比色法檢測不同濃度的替加環(huán)素（0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol

4、/L）對人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)應(yīng)用BrdU免疫熒光對替加環(huán)素抑制A375和MV3細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析。
　　2.應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞分析檢測替加環(huán)素對細(xì)胞周期的影響；不同濃度的替加環(huán)素（0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）處理后，應(yīng)用Western blot檢測周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討替加環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制。
　　3.應(yīng)用24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwe

5、ll小室實(shí)驗(yàn)檢測替加環(huán)素對人A375和 MV3黑色素瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的影響；不同濃度的替加環(huán)素（0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）處理后，應(yīng)用Western blot檢測遷移侵襲相關(guān)的EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)蛋白的表達(dá)，探討替加環(huán)素抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　4.軟瓊脂克隆形成分析和小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證替加環(huán)素對人A375和MV3黑色素瘤細(xì)胞成瘤性的影響。
　　5.應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)以慢病毒為載

6、體上調(diào)p21的表達(dá)后應(yīng)用替加環(huán)素，檢測其對人A375和MV3惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、周期、轉(zhuǎn)移和成瘤恢復(fù)性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT結(jié)果均顯示：替加環(huán)素能抑制A375和MV3的細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)明顯的濃度（0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）依賴效應(yīng)關(guān)系，且藥物濃度越大其抑制作用越顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BrdU免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，與對照組相比，替加環(huán)素處理

7、組BrdU陽性細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05）。
　　2.PI單染流式細(xì)胞分析顯示：與對照組相比，替加環(huán)素處理組細(xì)胞周期G0/G1期比例顯著增加（P<0.05）。Western blot檢測相關(guān)周期蛋白顯示：與對照組相比，替加環(huán)素處理組的細(xì)胞周期蛋白CDK2和CyclinE的表達(dá)量有所下調(diào)；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(CDKN1A, p21CIP1/Waf1)的表達(dá)量也明顯下調(diào)，并呈現(xiàn)明顯的濃度（0μmol/L、2μmol/

8、L、5μmol/L、10μmol/L）和時(shí)間（0h、24h、48h、72h）依賴效應(yīng)關(guān)系。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)均顯示：與對照組相比，替加環(huán)素處理組顯著抑制A375和MV3的遷移和侵襲，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間（24h、48h、72h）依賴效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）；Western blot檢測相關(guān)遷移侵襲的EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)蛋白顯示：替加環(huán)素處理組的EMT蛋白E-Cadherin的表達(dá)量有所上調(diào)，EMT蛋白

9、Vimentin的表達(dá)量有所下調(diào)，并呈現(xiàn)明顯的濃度（0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）和時(shí)間（0h、24h、48h、72h）依賴效應(yīng)關(guān)系。
　　4.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：與對照組相比，替加環(huán)素處理組克隆形成數(shù)顯著降低（P<0.05）；黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)異種移植NOD/SCID小鼠模型的研究結(jié)果顯示替加環(huán)素治療組的腫瘤體積和平均瘤重顯著低于對照組（P<0.05）。
　　5.應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)以慢病毒

10、為載體上調(diào)p21的表達(dá)后顯示：與對照組（單一應(yīng)用DMSO或替加環(huán)素）相比，處理組（過表達(dá)p21后應(yīng)用替加環(huán)素）恢復(fù)了替加環(huán)素對A375和MV3惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、周期、轉(zhuǎn)移和成瘤的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)外研究證明替加環(huán)素通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖；而且通過抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲；同時(shí)還明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞克隆形成及小鼠體內(nèi)