芬戈莫德(FTY720)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）白質(zhì)的脫髓鞘病變作為特點(diǎn)，遺傳易感個(gè)體與環(huán)境因素共同作用發(fā)生的自身免疫性疾病。其病因和機(jī)制尚未完全明確，但目前發(fā)現(xiàn)一些炎性細(xì)胞因子是導(dǎo)致其發(fā)生的主要原因。各種細(xì)胞因子以自分泌或者旁分泌的形式，參與該疾病免疫反應(yīng)和組織修復(fù)過(guò)程，并且對(duì)多發(fā)性硬化病情的嚴(yán)重程度和發(fā)展起決定性作用。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是一種以特異性致敏的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主

2、，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（MS）病研究的理想動(dòng)物模型，對(duì)研究臨床神經(jīng)免疫學(xué)具有重要意義。芬戈莫德（fingolimod,FTY720）是從冬蟲夏草中提取的有效成分-多球殼菌素（myriocin,ISP-1）通過(guò)去除手性中心、改變側(cè)鏈等處理而合成的新型免疫抑制劑。FTY720的免疫抑制主要通過(guò)激動(dòng)鞘氨醇-1-磷酸鹽（sphingosine-1-phosphate,S

3、1P）受體起作用，在體內(nèi)主要經(jīng)鞘氨醇激酶2的作用轉(zhuǎn)化成單磷酸酯化合物（FTY720-P）進(jìn)而發(fā)揮作用。并且，不同于其他用于治療MS的藥劑，F(xiàn)TY720獨(dú)有的親脂特性可以使它輕松的進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)以芬戈莫德作為干預(yù)藥物，觀察EAE小鼠及應(yīng)用芬戈莫德治療后小鼠的發(fā)病率、發(fā)病的嚴(yán)重程度以及芬戈莫德對(duì)其病程的影響。研究芬戈莫德對(duì)EAE小鼠表達(dá)促炎或抑炎細(xì)胞因子IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3的影響以及FTY720是否可以減

4、輕EAE小鼠脊髓組織中的炎性浸潤(rùn)程度，進(jìn)而研究芬戈莫德是否對(duì)EAE起保護(hù)作用。
　　方法：將60只周齡在8至10周，體重為18g至20g的雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成control組、EAE組和FTY720組，各組分別為20只。以為抗原建立EAE動(dòng)物模型。FTY720組小鼠自EAE免疫當(dāng)天起，給予FTY7200.3mg/kg每日灌胃；control組及EAE組小鼠自EAE免疫當(dāng)天起，給予等量的生理鹽水每日灌胃。從免疫第1天開(kāi)始

5、，采用雙盲法每日早晚（8:00和16:00）兩次由兩名觀察者分別對(duì)小鼠進(jìn)行稱重、神經(jīng)功能評(píng)分（采用weaver15分法）直至處死。于免疫后第20天，相當(dāng)于小鼠發(fā)病高峰期，處死小鼠。從control組、EAE組、FTY720組分別取15只小鼠，斷頸處死，在冰盤上迅速取出腦、脊髓，液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)脊髓中IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3表達(dá)水平。從control組、EAE組、FTY72

6、0組分別取5只小鼠用4％多聚甲醛灌注固定后取脊髓腰膨脹大部分，經(jīng)固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片等過(guò)程后制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOVA方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料均數(shù)的組間比較應(yīng)用snk-q檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)病率以百分?jǐn)?shù)表示，各組間發(fā)病率的比較采用卡方檢

7、測(cè)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.FTY720組發(fā)病率較EAE組顯著降低（P<0.05）。
　　2.在發(fā)病第20天，F(xiàn)TY720組平均神經(jīng)功能評(píng)分均較EAE組顯著降低去（P<0.05）。
　　3.各組小鼠脊髓組織中IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3表達(dá)水平：在發(fā)病20天時(shí)，與Control組相比，EAE組IL-17、RORγt水平均增高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；與 EAE組

8、相比，F(xiàn)TY720組IL-17、RORγt水平均降低，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在發(fā)病20天時(shí)，與Control組相比，EAE組TGF-β、FOXP3水平均降低，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；與EAE組相比，F(xiàn)TY720組TGF-β、FOXP3水平均增高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　4.HE染色：在發(fā)病20天時(shí)，與Control組相比，EAE組和FTY720組小鼠脊髓組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯增多，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、（P<0.05）；與EAE組相比，F(xiàn)TY720組小鼠脊髓組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減少，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.FTY720可以降低EAE小鼠發(fā)病率，延遲EAE小鼠發(fā)病的起始時(shí)間，減輕神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，對(duì)EAE小鼠具有保護(hù)作用。
　　2.FTY720可以增高EAE小鼠脊髓組織中抗炎細(xì)胞因子TGF-β、FOXP3的表達(dá)水平，并降低EAE小鼠脊髓組織中促炎細(xì)胞因子IL