HMGB1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎病程中的作用.pdf

1、背景：高遷移率族蛋白1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合核蛋白，HMGB1的表達(dá)量、細(xì)胞定位和亞細(xì)胞定位模式?jīng)Q定其作用。近期研究表明，HMGB1參與了自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生，同時(shí)當(dāng)脊髓和腦損傷時(shí) HMGB1導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)炎癥，但在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中脊髓組織HMGB1表達(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化仍不清楚。本研究為揭示HMGB1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experi

2、mental autoimmune encephalomyelitis，EAE）病程中的作用提供了新的證據(jù)，局部阻斷HMGB1緩解EAE臨床癥狀和抑制CNS炎癥提供了新的治療思路。
　　目的：闡明 EAE疾病病程中成年小鼠脊髓組織 HMGB1數(shù)量、細(xì)胞定位和亞細(xì)胞定位以及給予HMGB1拮抗劑后對(duì)EAE疾病的影響。
　　方法：利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型，根據(jù)EAE的臨床癥狀和疾病發(fā)展趨勢(shì)將

3、EAE劃分為發(fā)病前期（Pre-onset）、發(fā)病初期（Onset）、高峰期（Peak）和慢性期（Chronic）四個(gè)時(shí)期。以正常C57BL/6小鼠作為對(duì)照。在EAE病程相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取材進(jìn)行以下檢測(cè)：
　　1.通過蛋白印跡技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)EAE病程中脊髓組織HMGB1表達(dá)。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè) EAE病程中不同體液（血清、脊髓組織間液和腦脊液）中HMGB1的水平。通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白印跡技術(shù)檢驗(yàn)脊髓組織中細(xì)胞核和

4、胞漿的內(nèi)源性HMGB1表達(dá)情況。通過免疫熒光雙重染色和免疫組織化學(xué)染色觀察了EAE病程中脊髓組織TLR4的動(dòng)態(tài)表達(dá)和TLR4在CNS中細(xì)胞定位。同時(shí)，通過蘇木素伊紅染色檢測(cè)EAE病程中脊髓炎性細(xì)胞浸潤情況。
　　2.通過免疫熒光雙重染色觀察HMGB1在正常成年小鼠脊髓組織、CNS細(xì)胞株（小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 N2a、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 BV2和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87）的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞核定位，體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元和

5、星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步確定胞核HMGB1的表達(dá)。通過免疫熒光雙重染色觀察 EAE病程中脊髓組織HMGB1表達(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化。
　　3.觀察HMGB1拮抗劑（甘草甜素（glycyrrhizin，GL））或中和性抗HMGB1單克隆抗體（neutralizing anti-HMGB1 monoclonal antibody，HMGB1 Ab））對(duì)EAE脫髓鞘的影響，通過預(yù)防性和治療性腹腔注射GL、HMGB1 Ab或側(cè)腦室注射HMGB1 Ab

6、，評(píng)估EAE臨床癥狀、病理特征、不同體液中HMGB1的水平、脊髓組織HMGB1的表達(dá)、CNS星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腹腔給予HMGB1 Ab處理后對(duì)脾臟Th1、Th17細(xì)胞數(shù)量的影響。
　　結(jié)果：
　　1. EAE病程中脊髓組織表達(dá)HMGB1增加：與Normal組相比較，EAE病程四個(gè)時(shí)期脊髓組織表達(dá)HMGB1總蛋白均顯著增加，于Onset期達(dá)到最高峰。不同體液（血清、脊髓組織間液和腦脊液）中胞

7、外HMGB1的水平增加；EAE高峰期脊髓細(xì)胞HMGB1從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位；EAE病程中脊髓組織表達(dá)TLR4增加，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá) TLR4。組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脊髓組織中有炎性細(xì)胞浸潤，特別是在EAE發(fā)病初期和高峰期。
　　2.正常狀態(tài)下脊髓組織部分星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的胞核表達(dá)HMGB1，少許神經(jīng)元的胞核表達(dá)HMGB1；CNS細(xì)胞株（小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（N2a）、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（

8、U87））的胞核表達(dá) HMGB1。同時(shí)，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞核表達(dá)HMGB1。然而，EAE病程中脊髓組織HMGB1總蛋白和胞外HMGB1水平升高，HMGB1陽性的星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，伴隨著胞外HMGB1水平升高，定居于脊髓前角和中央管周圍區(qū)域的神經(jīng)元核HMGB1向胞漿轉(zhuǎn)位。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔預(yù)防性給予GL不影響EAE發(fā)生、發(fā)展，腹腔治療性給予GL能夠緩解EAE臨床癥狀，側(cè)腦室治療性

9、給予HMGB1 Ab處理幾乎完全抑制EAE發(fā)生、發(fā)展。治療性給予HMGB1拮抗劑GL或HMGB1 Ab發(fā)揮有效的抗炎作用緩解 EAE臨床癥狀，減輕脊髓組織炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失，降低不同體液中HMGB1水平和脊髓組織HMGB1表達(dá)，下調(diào)外周脾臟組織Th1和Th17細(xì)胞數(shù)量，抑制EAE脊髓組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)降低神經(jīng)元的損傷。
　　結(jié)論：本研究觀察了 EAE疾病發(fā)生、發(fā)展過程中脊髓組織 HMGB1表達(dá)模式的動(dòng)態(tài)