CRABP2基因過表達逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥對腫瘤微環(huán)境影響探究及卵巢癌3D共培養(yǎng)初探.pdf

1、目的：本課題組在前期已經(jīng)成功建立了卵巢癌的裸鼠順鉑耐藥模型，得到順鉑獲得性耐藥卵巢癌細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ，然后成功構(gòu)建了CRABP2基因過表達的順鉑耐藥卵巢癌細胞SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2，并且采用mcherry紅色熒光標記。檢測CRABP2基因過表達后對卵巢癌微環(huán)境中細胞因子的影響以及CRABP2基因過表達逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞鉑類耐藥在動物模型中的表達驗證，探討CRABP2基因過表達后對細胞凋亡與細胞周期信號通

2、路的影響。另外，建立SKOV3/DDPⅢ與間皮細胞，成纖維細胞三維共培養(yǎng)模型更好地模擬卵巢癌細胞的生長微環(huán)境，對三維共培養(yǎng)方法進行初探。為尋找逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的新的靶點奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用課題組前期已經(jīng)成功建立的順鉑獲得性卵巢癌耐藥細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ和親本順鉑敏感細胞株SKOV3-GFP，分別種植在裸鼠皮下待其成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù)，實時熒光定量PCR檢測細胞因子的動態(tài)表達變化。利用CRABP2基因過表達的

3、順鉑耐藥卵巢癌細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2和空載對照組細胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-mcherry，分別種植在裸鼠皮下待其成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù)，Western Blot檢測CRABP2基因過表達后對移植瘤下游Fas細胞凋亡信號通路上節(jié)點基因的蛋白表達和周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達的影響。同時進行實時熒光定量PCR檢測細胞因子的動態(tài)表達變化。采集人腹腔大網(wǎng)膜標本，分離純化得到間皮細胞和成纖維細胞。利用Transwell

4、小室，間皮細胞，成纖維細胞，SKOV3/DDPⅢ搭建三維共培養(yǎng)模型，底層為成纖維細胞，中層為間皮細胞，上層為SKOV3/DDPⅢ。利用Clarity法包埋成去脂透明的高通透性立體模型，利用免疫熒光法觀察三維共培養(yǎng)模型并進行三維成像。
　　結(jié)果：QRT-PCR的結(jié)果表明：注射順鉑藥物后，敏感組表達高于耐藥組的細胞因子有22個；敏感組表達低于耐藥組的細胞因子有5個。在過表達CRABP2基因和其空載對照組中，注射順鉑藥物后，空載對照組表

5、達低于過表達CRABP2組的細胞因子有20個；空載對照組表達高于過表達CRABP2組的細胞因子有7個。注射順鉑藥物后，空載對照組表達高于過表達CRABP2組中有4個細胞因子與注射順鉑藥物后的敏感組表達低于耐藥組的細胞因子相同，過表達CRABP2組表達高于空載對照組中有19個細胞因子與敏感組表達高于耐藥組的細胞因子相同。因此，過表達CRABP2基因通過影響腫瘤的微環(huán)境來逆轉(zhuǎn)卵巢癌的鉑類耐藥。
　　相對于SKOV3-GFP/DDPⅡ和

6、空載對照組的SKOV3-GFP/DDPⅡ-mcherry細胞株的裸鼠皮下移植瘤而言，過表達CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2細胞株的裸鼠皮下移植瘤的細胞周期被抑制，細胞凋亡途徑被激活：隨順鉑注射次數(shù)的增加，F(xiàn)as信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的Fas，F(xiàn)ADD，Caspase9和Caspase3在過表達CRABP2移植瘤組織中的蛋白質(zhì)表達相對于耐藥移植瘤組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢（P＜0.05），而PARP1則在過

7、表達CRABP2移植瘤組織中蛋白質(zhì)表達相對于耐藥組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢（P＜0.05）；隨著順鉑次數(shù)的增加，細胞周期的依賴性蛋白激酶CDK6，CDK4和細胞周期蛋白cyclinD1在過表達CRABP2移植瘤組織中的蛋白質(zhì)表達相對于耐藥移植瘤組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢（P＜0.05），而細胞周期阻斷劑p27 kip1則在過表達CRABP2移植瘤組織中蛋白質(zhì)表達相對于耐藥組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出

8、上調(diào)趨勢（P＜0.05）。即過表達CRABP2基因后的卵巢癌順鉑耐藥細胞恢復(fù)了對順鉑的敏感性。
　　三位共培養(yǎng)模型免疫熒光觀察上層為SKOV3/DDPⅢ，中間為間皮細胞，下層為混有成纖維細胞的基質(zhì)膠。
　　結(jié)論：過表達CRABP2后可使耐藥的卵巢癌細胞恢復(fù)對順鉑的敏感性，影響腫瘤的微環(huán)境抑制細胞周期中的G1/S期、激活Fas凋亡信號通路的作用來逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥。這給臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的治療提供了新的靶點和理論基礎(chǔ)。并且利