低氧預(yù)處理人脂肪間充質(zhì)干細胞聯(lián)合臍血單核細胞治療大鼠急性心肌梗死.pdf

1、心肌梗死是嚴重威脅人類健康的疾病。我國每年約有2.9億人罹患心血管疾病，并有350萬人因此而喪生。心血管疾病死亡率位居我國城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，且呈逐年攀升趨勢。目前心肌梗死的主要治療手段還是藥物和手術(shù)，雖然它們能夠促進血管再通，減輕心肌的持續(xù)性損傷，但二者對梗死的心肌組織并無再生作用，且不能有效逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的纖維化。干細胞移植是一種新興的治療方法，其目的是促進缺血區(qū)心肌和血管生成，減少心肌細胞凋亡，減輕心室重塑。脂肪間充質(zhì)干細胞

2、(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ASC)以其獨特的優(yōu)勢，逐漸成為當(dāng)前研究的熱點。雖然ASC的安全性和有效性已得到初步認識，但其在體內(nèi)的存活和顯效還受到多個環(huán)節(jié)的影響。為了提高干細胞在局部的存活效率，研究者們開始對干細胞進行體外預(yù)處理或者對組織微環(huán)境進行改善，以利于細胞的長期存活和發(fā)揮修復(fù)功能。
　　低氧預(yù)處理(Hypoxia precondition，HP)是增加干細胞存活率的簡單有

3、效的方法。為了適應(yīng)移植后在梗死區(qū)局部的低氧環(huán)境，在體外對ASC進行低氧培養(yǎng)，以此增強細胞對低氧的耐受性和抗凋亡能力，同時促進其分泌多種生長因子，有利于細胞進入體內(nèi)后發(fā)揮修復(fù)和再生功能。
　　臍血單核細胞(Cord blood mononuclear cells，CBMNCs)能夠促進血管新生和血管內(nèi)皮化，改善梗死局部的微循環(huán)。內(nèi)皮細胞的再血管化可以為移植的干細胞帶來營養(yǎng)和氧氣，有利于干細胞在局部的存活。因此，將體外預(yù)處理與體內(nèi)微環(huán)

4、境的改善結(jié)合起來，可能更有利于細胞在局部的長期存活。
　　目的：
　　1.研究ASC的培養(yǎng)，鑒定和體外誘導(dǎo)分化能力;以及CBMNCs分離和凍存?zhèn)溆?
　　2.檢測低氧預(yù)處理前后ASC的基因表達變化;并體外模擬心梗環(huán)境培養(yǎng)HP-ASC和ASC，比較二者基因表達水平的變化;
　　3.評價HP-ASC治療大鼠心肌梗死是否優(yōu)于ASC;
　　4.評價HP-ASC聯(lián)合CBMNCs治療大鼠心肌梗死是否優(yōu)于單一細胞移植效果

5、。
　　方法：
　　1.以健康成人脂肪抽吸術(shù)后的脂肪組織為實驗對象，用膠原酶消化分解后，離心取下層SVF細胞，接種培養(yǎng)。用MTT法測量細胞密度并繪制ASC生長曲線;流式細胞術(shù)檢測ASC細胞表面標記;分別以成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)ASC分化，利用組織化學(xué)染色和免疫組化染色檢測其多向分化潛能。來自健康嬰兒的臍血離心沉降法分離出CBMNCs，檢測細胞數(shù)量及活性細胞比例，凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.ASC在低氧(2％O2)條件下培

6、養(yǎng)24h，提取細胞RNA，比較HP-ASC與未處理ASC基因表達情況;模擬體內(nèi)心梗局部微環(huán)境，取大鼠心梗后3d的心臟組織，研磨成漿，加入血清及必須氨基酸等配制成心梗混合液。將HP-ASC和ASC在此混合液中培養(yǎng)5d，檢測細胞在微環(huán)境誘導(dǎo)下基因表達的變化;
　　3.兩月齡Wistar雌性大鼠30只，按照隨機數(shù)法將實驗動物隨機分為3組，HP-ASC組，ASC組和PBS組，每組各10只大鼠。結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立心肌梗死損傷模型，動物

7、心梗后即刻心肌內(nèi)注射干細胞（總量:2×106）或PBS。細胞移植后7d和15d每組分別處死5只大鼠，收集心臟組織，制作冰凍組織切片和石蠟組織切片。比較各組之間心梗部位的大體形態(tài)學(xué)變化，心梗區(qū)占左心室比例，細胞移植效率，細胞凋亡數(shù)量和新生血管密度。
　　4.兩月齡Wistar雌性大鼠60只，按照隨機數(shù)法將實驗動物隨機分為4組，HP-ASC組，HP-ASC+CBMNCs組，CBMNCs組和PBS組，每組各15只大鼠。模型成功后即刻進行

8、細胞移植，細胞總量為2×106（聯(lián)合組細胞比例1∶1）。每組動物分別在手術(shù)后7d，15d和30d各取5只處死。比較各組之間心梗部位的大體形態(tài)學(xué)變化，心梗區(qū)占左心室比例和室壁厚度，細胞移植存活率和新生血管密度。
　　結(jié)果：
　　1.原代ASC接種6h后，部分細胞開始貼壁生長，24-48h后細胞開始出現(xiàn)集落樣增長(CFU)。第3代以后，細胞呈典型纖維母細胞樣梭形外觀，開始呈漩渦狀生長，MTT法檢測顯示，ASC的對數(shù)生長期為3-7

9、d，第8d開始進入平臺期。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，ASC細胞表達CD34(-)/CD45(-)/CD90(+)/CD105(+)/CD73(+)/CD44(+)，符合間充質(zhì)干細胞表型。誘導(dǎo)分化試驗表明， ASC可以向成脂、成骨和成軟骨方向分化。CBMNCs分離后，單核細胞數(shù)量達到8.9×109，活性細胞計數(shù)結(jié)果顯示，活性細胞數(shù)占所有有核細胞的93.16％。
　　2.與ASC相比，HP-ASC表達多種生長因子及其受體水平增高，與干細

10、胞特性相關(guān)的基因K1f4和Oct4略有增高，而Nanog和Sox2表達卻較后者有所降低。此外，HP-ASC中與低氧誘導(dǎo)表達相關(guān)的基因-血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)和基質(zhì)細胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1，SDF-1)均表達增高，分別為ASC組的1.38倍和1.98倍。與細胞遷移和植入相關(guān)的基因，除金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue inhibitor of me

11、talloproteinase，TIMP-1）下降外，趨化因子受體-4(CXCR4)，細胞間粘附分子(Intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1和ICAM-2)的表達都有所增加。體外模擬心梗環(huán)境培養(yǎng)可以促進HP-ASC-T表達心肌特異性標志物(CX43，F(xiàn)ABP4，GATA-4)和促血管生長因子（VEGF），同時也可促進HP-ASC-T表達多種生長因子及其受體。
　　3.動物試驗表明，與

12、PBS組相比，HP-ASC組和ASC組在心梗后7d及15d均可顯著減少心梗面積，增加細胞存活數(shù)量，減少凋亡細胞數(shù)量，以及顯著增加新生血管數(shù)量。而HP-ASC組較ASC組改善更為明顯。
　　4.心梗大鼠進行細胞移植后30天，HP-ASC組，HP-ASC+CBMNCs組和CBMNCs組均比PBS組明顯改善了心功能。其中，HP-ASC組改善效果更好。組織學(xué)檢測表明，HP-ASC組的心梗比例和心梗室壁厚度，細胞存活數(shù)量和新生血管數(shù)量均比其

13、他對照組改善更好。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗所培養(yǎng)ASC細胞表達CD34(-)/CD45(-)/CD90（+）/CD105(+)/CD73(+)/CD44(+)，符合間充質(zhì)干細胞表型。ASC有多向分化潛能，經(jīng)體外誘導(dǎo)可向成骨、成脂、成軟骨方向分化。離心沉降法可獲得臨床級數(shù)量的CBMNCs，分離后細胞存活率高。
　　2.低氧預(yù)處理后，HP-ASC表達多種生長因子及其受體升高。模擬體內(nèi)心梗局部微環(huán)境可使HP-ASC表達心