HPI-4對人上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景與目的:卵巢癌致死率位居于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位。其起病比較隱匿，缺乏相對特異性的臨床癥狀、迅速實(shí)時和卓有成效的診斷手段和治療方案。因此，它在被明確診斷時多已為晚期且往往預(yù)后不良。卵巢惡性腫瘤目前以手術(shù)為主要治療方式。雖然輔以化學(xué)藥物治療、放射治療及傳統(tǒng)的中醫(yī)藥等，但最終的治療效果往往并不十分理想。目前腫瘤相關(guān)的研究已逐步深入到了細(xì)胞、分子水平。卵巢癌發(fā)生發(fā)展的研究也不例外。其中，關(guān)于細(xì)胞間眾多信號通路與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究

2、也已成為近年來的熱點(diǎn)。
　　Hedgehog(Hh)信號通路，第一次是在對果蠅進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)的。我們是在對其胚胎體節(jié)發(fā)育調(diào)節(jié)的探索中認(rèn)識了Hh信號通路。后來又在脊椎動物中證實(shí)存在并成功分離出了其中重要的相關(guān)基因。Hh信號通路，作為體內(nèi)非常具有典范性的信號通道之一，不但與胚胎的發(fā)生發(fā)育有關(guān)聯(lián)，還與組織更新有著極為密切的聯(lián)系。它還在人類所熟知的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起了巨大作用。截止到目前相關(guān)研究表明：Hh信號通路，在宮頸癌、子宮

3、內(nèi)膜癌等中的影響及作用機(jī)制已有了一些較為深入的研究。當(dāng)然，卵巢癌也不例外。人卵巢癌組織中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)：其內(nèi)存在有明顯的該通道的異?；罨?、相關(guān)蛋白的高表達(dá)。一些報道提出：Hh信號通路的異常激活在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。抑制該通路可導(dǎo)致卵巢癌的細(xì)胞生長抑制及癌細(xì)胞的凋亡。這也得到相關(guān)的研究的證實(shí)。因此，Hh信號通路的抑制劑可能是卵巢癌有效的治療途徑之一。
　　GLI蛋白，其作為Hh通路的下游成員而被大家熟知。它不僅僅介導(dǎo)了

4、多數(shù)的Hh信號通路，并且還在多種比較常見的腫瘤，如乳腺癌，膠質(zhì)瘤等，都有異常的活化及增殖。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的并研究的Hh信號通道下游的小分子抑制劑有GANT61、GANT58和HPI系列等。它們均為通過抑制一個特殊的位點(diǎn)―GLI蛋白，來抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長。關(guān)于Hh信號通路在卵巢癌中的作用，目前研究多集中在上游位點(diǎn)。但是關(guān)于 GLI誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的該通道的下游位點(diǎn)相關(guān)研究及報道較少。有研究稱，HPI-4，作為一個下游小分子抑制劑，可能是通過抑

5、制Hh通路的下游而發(fā)揮作用的。HPI-4抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制可能是：抑制了該通路中初始纖毛細(xì)胞（具有感受器功能）。然而目前關(guān)于HPI-4在人上皮性卵巢癌中的研究國內(nèi)外報道比較少，其具體的作用機(jī)制目前仍不十分明晰。
　　幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中都可以見到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的紊亂及失調(diào)控的現(xiàn)象。所以說，腫瘤就是一種細(xì)胞周期失去調(diào)節(jié)的特殊疾病。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)，是特別重要的核內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白之一，其存在于細(xì)胞周期中。它的過度表達(dá)可

6、導(dǎo)致G1/S檢測點(diǎn)G1/S的缺陷，并且在G1期間隔變短的情況下使細(xì)胞順利越過G1/S限制點(diǎn)。在這種情況下細(xì)胞的抗增殖功能就消失了，最終變?yōu)槲覀兯赖漠惓＜?xì)胞。這些不受細(xì)胞周期調(diào)控的異常細(xì)胞，出現(xiàn)增殖、不斷累積，最終會引起癌變。因此，CyclinD1蛋白，異常表達(dá)于細(xì)胞周期失控中，進(jìn)一步發(fā)展成為細(xì)胞異常增殖。其在導(dǎo)致癌變的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究擬觀察HPI-4對A2780細(xì)胞增殖、凋亡的影響，及其對CyclinD1

7、、GLI1蛋白表達(dá)的影響。以進(jìn)一步探討：Hh信號通路，參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展可能的機(jī)制。本研究不僅給臨床卵巢癌的靶向治療提供了一個新的靶向藥物選擇，也為小分子抑制劑HPI-4在卵巢癌中的進(jìn)一步研究夯實(shí)了可靠的理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法:復(fù)蘇和培養(yǎng)人上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞，至對數(shù)生長期。首先用MTT法分別檢測不同濃度、不同時間下Hh信號通路抑制劑HPI-4作用下A2780細(xì)胞的抑制率。然后通過流式細(xì)胞儀測定不同濃度下 HPI-4對人

8、上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞作用48小時后對細(xì)胞周期分布及凋亡的影響。最后采用免疫印跡檢測CyclinD1和GLI1在人上皮性卵巢癌 A2780細(xì)胞的表達(dá)情況，以及受到不同濃度HPI-4作用48小時后的兩者表達(dá)有無改變。
　　采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Hh通路抑制劑HPI-4作用于A2780細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。且隨著

9、HPI-4濃度的增加，作用時間的延長，其對A2780細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：HPI-4作用于人上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞48h后，細(xì)胞周期分化受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率明顯增高。且隨著 HPI-4濃度的增加，G0~G1期細(xì)胞百分比也逐漸增加。S期細(xì)胞百分比逐漸減少，進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞逐漸減少。且細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈現(xiàn)濃度依賴性。G2/M期的百分比則無顯著性差異。
　

10、　3、免疫印跡結(jié)果顯示：CyclinD1和GLI1在人上皮性卵巢癌 A2780細(xì)胞中高表達(dá)。加入藥物HPI-4后CyclinD1和GLI1蛋白表達(dá)均下降，且隨著藥物濃度的增加而逐漸下降，呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　1、HPI-4可以抑制體外培養(yǎng)的人上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞增殖，且呈劑量、時間依賴性；
　　2、HPI-4對A2780細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)為阻止DNA合成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　3、上皮性卵巢癌A2