IscA蛋白在鐵硫簇組裝中的功能及其介導(dǎo)的銅離子殺菌機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等分析手段系統(tǒng)的研究，較為全面的闡述Escherichia coli IscA及其同源蛋白SufA在鐵硫簇組裝中的生理功能，以及銅離子結(jié)合IscA蛋白質(zhì)介導(dǎo)的鐵硫簇組裝障礙而殺菌的具體機(jī)制，從而為鐵硫簇組裝機(jī)制和銅的殺菌機(jī)制研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.Escherichia coli IscA/SufA蛋白在不同類(lèi)型鐵硫簇合成中的功能研究
　　2.銅離子結(jié)

2、合E.coli IscA蛋白介導(dǎo)的殺菌機(jī)制研究
　　結(jié)果:
　　1.E.coli IscA/SufA蛋白在不同類(lèi)型鐵硫簇合成中的功能研究
　　1.1.添加支鏈氨基酸和硫胺素能部分恢復(fù)E.coli iscA/sufA雙突變菌在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)在有氧生長(zhǎng)條件下，E.coli iscA/sufA雙突變菌在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中產(chǎn)生不能生長(zhǎng)的表型，在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.0μg/mL的硫胺素不能恢復(fù)E.coli iscA/s

3、ufA雙突變菌的生長(zhǎng)，但添加90μg/mL的三種支鏈氨基酸能少量恢復(fù)E.coli iscA/sufA雙突變菌的生長(zhǎng)，同時(shí)添加硫胺素和支鏈氨基酸入M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，能夠進(jìn)一步增加E.coli iscA/sufA雙突變菌的生長(zhǎng)。
　　1.2.有氧生長(zhǎng)條件下，iscA/sufA雙突變菌內(nèi)IlvD蛋白不能組裝[4Fe-4S]鐵硫簇在有氧條件下，支鏈氨基酸合成途徑中IlvD，表達(dá)于fscA/sufA雙突變菌中與表達(dá)于野生型、iscA和suf

4、A單突變菌相比，幾乎沒(méi)有活性，而蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯影響。純化于野生型E.coli中的IlvD蛋白在415 nm具有一個(gè)典型的[4Fe-4S]鐵硫簇且有完全的活性，而純化于E.coli iscA/sufA雙突變菌中的IlvD蛋白消失了415nm處吸收峰且沒(méi)有活性，IlvD蛋白鐵和硫含量測(cè)定顯示純化于野生型E.coli中的每摩爾IlvD蛋白含有1.6±0.4摩爾鐵和1.4±0.3摩爾無(wú)機(jī)硫，表明大約40％純化的IlvD蛋白含有完整的[4Fe

5、-4S]鐵硫簇。相反，純化于E.coli iscA/sufA雙突變菌中的IlvD蛋白測(cè)不到鐵和硫的含量。
　　1.3.IscA-Fe/SufA-Fe能提供鐵給二羥酸脫水酶IlvD進(jìn)行[4Fe-4S]鐵硫簇的體外組裝 IscA-Fe與apo-IlvD、半胱氨酸脫硫酶IscS、L-半胱氨酸(L-cysteine)和二硫蘇糖醇在37℃有氧條件下孵育，IlvD活性很快得到恢復(fù)，而對(duì)照樣品apo-IscA，在孵育后IlvD活性沒(méi)有恢復(fù)。Il

6、vD經(jīng)離子交換層析柱MonoQ再次純化后蛋白在415 nm處出現(xiàn)特異的IlvD鐵硫簇吸收峰，表明IlvD經(jīng)過(guò)體外重組后[4Fe-4S]鐵硫簇已經(jīng)組裝到蛋白質(zhì)上;利用SufA-Fe作為鐵的供體，我們獲得了類(lèi)似的結(jié)果。
　　1.4.IscA/SufA蛋白參與了其它鐵硫酶中[4Fe-4S]鐵硫簇組裝在野生型E.coli和iscA/sufA雙突變菌中重組表達(dá)硫胺素生物合成途徑中的ThiC、三羧酸循環(huán)中途徑中的aconitase B和DNA

7、堿基切除修復(fù)途徑中核酸內(nèi)切酶Ⅲ，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示IscA/SufA的缺失沒(méi)有明顯的影響蛋白質(zhì)的表達(dá)和接下來(lái)的純化，蛋白質(zhì)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示純化于野生型E.coli中的ThiC、aconitaseB和核酸內(nèi)切酶Ⅲ分別在410、413和419nm處出現(xiàn)[4Fe-4S]結(jié)合的吸收峰，并且蛋白質(zhì)都測(cè)到一定濃度的鐵和硫，而純化于iscA/sufA雙突變菌中的ThiC、aconitaseB和核酸內(nèi)切酶Ⅲ沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)鐵硫簇的吸收峰也測(cè)

8、不到鐵和硫的含量。
　　2.銅離子結(jié)合E.coli IscA蛋白介導(dǎo)的殺菌機(jī)制研究
　　2.1.在ISC鐵硫簇組裝系統(tǒng)中IscA蛋白具有獨(dú)特的且很強(qiáng)的銅離子結(jié)合能力在LB培養(yǎng)基中添加200μM CuSO4對(duì)表達(dá)于copA/cueO/cusA三突變菌中IscS、IscU、HscB、HscA和Ferredoxin的全波長(zhǎng)掃描光譜幾乎沒(méi)有影響，唯獨(dú)IscA蛋白在258 nm處出現(xiàn)了1個(gè)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基與Cu(Ⅰ)結(jié)合的特異吸收峰

9、，蛋白中銅元素含量結(jié)果顯示每分子IscA蛋白二聚體含有0.60±0.09分子銅原子，而在IscS，HscB和HscA蛋白中只有非常微量或未檢測(cè)到銅元素，IscU和ferredoxin蛋白保留有少量，并且可重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)量的銅元素，但蛋白中銅元素在后續(xù)純化步驟中會(huì)進(jìn)一步減少，說(shuō)明銅離子與IscU和ferredoxin蛋白的結(jié)合力較弱;在添加200μM CuSO4 LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的copA/cueO/cusA三突變菌中表達(dá)并純化獲得的IscA

10、蛋白，無(wú)EPR信號(hào)，而當(dāng)使用2.5％(v/v)硝酸處理純化后的IscA蛋白，使其結(jié)合的Cu(Ⅰ)被氧化，出現(xiàn)了一個(gè)典型的以Cu(Ⅱ)為中心的EPR信號(hào)，定量Cu(Ⅱ)的EPR信號(hào)表明純化后的IscA蛋白含有0.55±0.12銅原子/IscA二聚體，與采用新亞銅試劑測(cè)定的結(jié)果基本一致;在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)copA/cueO/cusA三突變菌中重組IscA蛋白的表達(dá)，并且與不同濃度的銅離子孵育，結(jié)果表明，當(dāng)CuSO4濃度從0增加至1 mM時(shí)，

11、與IscA蛋白結(jié)合的銅離子逐步從0增加到大約1.4銅原子/IscA二聚體，然而copA/cueO/cusA三突變菌的生長(zhǎng)量卻降低了30％，細(xì)菌的生長(zhǎng)與IscA銅結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果顯示當(dāng)銅離子濃度從0增加到1mM時(shí)，銅離子與IscA蛋白的結(jié)合量與copA/cueO/cusA三突變菌的生長(zhǎng)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　2.2.IscA蛋白體外銅離子結(jié)合活性 apo-IscA與CuSO4共孵育并將IscA蛋白重新純化，隨著溶液中銅離子濃度的不斷

12、增加，純化獲得的IscA蛋白在258 nm處的吸收峰峰值和銅元素含量逐漸增加，并且當(dāng)CuSO4濃度為IscA蛋白兩倍以上時(shí)，IscA結(jié)合的銅離子含量達(dá)到飽和值（2.2±0.4銅原子/IscA二聚體），IscA結(jié)合的銅離子含量與低濃度銅離子時(shí)幾乎是線性關(guān)系，再純化的IscA蛋白，采用2.5％（v/v）硝酸處理就會(huì)出現(xiàn)了典型的Cu(Ⅱ)結(jié)合為中心的EPR信號(hào)，隨著溶液中CuSO4濃度的不斷增加，EPR信號(hào)強(qiáng)度也逐漸增加;離子交換層析法分析重

13、新純化后獲得的IscA蛋白，銅離子結(jié)合IscA蛋白后導(dǎo)致蛋白洗脫峰從第10和11管(apo-IscA)遷移至第13和14管（結(jié)合銅離子的IscA蛋白），表明IscA結(jié)合銅離子后其蛋白構(gòu)象可能發(fā)生顯著變化。
　　2.3.IscA中保守的半胱氨酸殘基參與了銅離子的結(jié)合當(dāng)將野生型apo-IscA與鐵/銅離子孵育分別生成鐵結(jié)合形式IscA（在315nm處有一吸收峰）或者銅結(jié)合形式IscA（在258 nm處有一吸收峰），與此相反，當(dāng)將突變型

14、IscA與鐵或銅離子孵育后未檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的吸收峰，蛋白質(zhì)中鐵和銅含量的測(cè)定結(jié)果顯示，突變體IscA與鐵/銅孵育并再純化后沒(méi)有測(cè)到鐵/銅含量，與光譜學(xué)分析的結(jié)果一致;在添加有鐵/銅離子的LB培養(yǎng)基中，在E.coli copA/cueO/cusA三突變菌中表達(dá)野生型IscA及其突變體蛋白，同樣，不像野生型IscA蛋白，IscA突變體蛋白沒(méi)有結(jié)合任何鐵或銅離子。這些表明IscA蛋白中三個(gè)保守半胱氨酸殘基是維持其鐵和銅離子結(jié)合活性必需位點(diǎn)。

15、>　　結(jié)論:根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:(1)IscA/SufA蛋白主要參與了有氧生長(zhǎng)條件下E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而不參與[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝，所以[4Fe-4S]鐵硫簇和[2Fe-2S]鐵硫簇可能具有完全不一樣的合成途徑;(2)IscA蛋白除了鐵結(jié)合能力外，還具有獨(dú)特的且很強(qiáng)的銅結(jié)合能力，IscA中三個(gè)保守的半胱氨酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合銅和鐵都很重要;(3)過(guò)量銅還能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IscA中鐵的結(jié)合位點(diǎn)，從

16、而影響E.coli中[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝，而對(duì)[2Fe-2S]鐵硫簇的組裝沒(méi)有明顯影響;(4)IscA的缺失或者培養(yǎng)基中加銅都能導(dǎo)致[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝障礙，而在IscA缺失情況下加銅不能進(jìn)一步加重[4Fe-4S]鐵硫簇的組裝缺陷，說(shuō)明IscA可能是銅的主要毒性靶點(diǎn);(5)銅對(duì)于鐵硫蛋白預(yù)先組裝好的[4Fe-4S]鐵硫簇沒(méi)有明顯的影響，而對(duì)于新合成的蛋白中[4Fe-4S]鐵硫簇組裝影響顯著，說(shuō)明銅主要是影響了鐵硫簇的合成