MitoNEET在細胞線粒體內(nèi)外鐵硫簇轉(zhuǎn)運中的作用.pdf

1、目的:
　　人線粒體蛋白mitoNEET是新近發(fā)現(xiàn)的由核基因編碼的定位在線粒體外膜上的低分子量蛋白，其含有一個[2Fe-2S]型鐵硫中心，該鐵硫中心由Cys72、Cys74、Cys83及His87四個氨基酸殘基配位結(jié)合。MitoNEET作為抗2型糖尿病藥物吡格列酮的靶蛋白而被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于真核和原核生物系統(tǒng)中，其可能參與多種生命活動過程，包括細胞自噬、凋亡、老齡化、糖尿病及體內(nèi)活性氧的平衡等。體外實驗中，mitoNEET蛋白可以

2、直接將鐵硫簇傳遞給目的蛋白，如fdx、aconitase1等;但其在細胞水平線粒體內(nèi)外鐵硫簇傳遞中的作用仍不是很清楚。本實驗通過研究細胞中mitoNEET不同表達情況下線粒體內(nèi)外鐵硫簇水平變化，從而分析mitoNEET在細胞線粒體內(nèi)外鐵硫簇轉(zhuǎn)運中的作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建mitoNEET干擾質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-mitoNEET。培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞與肝癌HepG2細胞，分別篩選其G418最低藥物

3、致死濃度。在MCF-7和HepG2細胞中轉(zhuǎn)染mitoNEET干擾質(zhì)粒及其對照空載，通過G418藥物篩選出穩(wěn)定低表達mitoNEET及其對照細胞株。
　　2.用熒光定量PCR和western blot測定細胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達水平，挑選和鑒定最佳干擾效果的穩(wěn)定低表達mitoNEET及其對照細胞株。
　　3.用CCK8細胞增殖實驗測定低表達mitoNEET及其對照細胞株的細胞增殖速率，分析低表達mitoNEE

4、T對細胞增殖的影響。
　　4.測定穩(wěn)定低表達mitoNEET及其對照細胞株線粒體內(nèi)的鐵硫蛋白活性和蛋白表達情況，從而反映線粒體內(nèi)鐵硫簇水平，包括aconitase2、complexⅠ和硫辛酸合成酶。同時測定細胞質(zhì)中的鐵硫蛋白活性和蛋白表達情況以反映細胞質(zhì)鐵硫簇水平，包括acoritase1和二氫嘧啶脫氫酶。比較低表達mitoNEET及其對照細胞株的細胞線粒體內(nèi)外鐵硫簇水平差異，從而分析mitoNEET蛋白在細胞線粒體鐵硫簇轉(zhuǎn)運中的

5、作用。
　　5.構(gòu)建重組mitoNEET野生型高表達質(zhì)粒，用于后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染。在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型高表達質(zhì)粒使細胞高表達mitoNEET，用熒光定量PCR和westemblot鑒定此時細胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達水平。
　　6.轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型高表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒，48h后測定細胞內(nèi)aconitase1、2的蛋白表達水平和酶活性，從而檢測高表達mitoNEET對細胞線粒體內(nèi)外鐵

6、硫簇水平變化的影響。
　　7.利用定點突變構(gòu)建mitoNEET突變型高表達質(zhì)粒(H87C和H87S)。在穩(wěn)定低表達mitoNEET細胞株中轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型和突變型高表達質(zhì)粒載體進行rescue實驗。用熒光定量PCR和western blot鑒定細胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達水平從而分析rescue對mitoNEET表達的恢復情況。
　　8.在如上轉(zhuǎn)染mitoNEET野生型和突變型(H87C和H87S)高

7、表達質(zhì)粒細胞中測定胞質(zhì)aconitase1的蛋白表達和酶活性，分析rescue對mitoNEET細胞鐵硫簇傳遞功能的影響。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定低表達mitoNEET細胞株的篩選、鑒定以及其對細胞增殖的影響。
　　利用RNAi干擾技術(shù)和G418藥物篩選獲得穩(wěn)定低表達mitoNEET細胞株及其對照細胞株。低表達mitoNEET細胞株的mitoNEET mRNA和蛋白表達均顯著性的低于未處理和對照細胞株。另外相對于未處

8、理和對照細胞株，mitoNEET低表達細胞的細胞增殖速率顯著性的下降。
　　2.低表達mitoNEET對線粒體內(nèi)外鐵硫簇水平的影響。
　　低表達mitoNEET不影響線粒體內(nèi)aconitase2的蛋白表達水平和酶活性，同時complexⅠ和硫辛酸合成酶的酶活性也沒有明顯的變化。另一方面，低表達mitoNEET后細胞質(zhì)中aconitase1蛋白表達不變，而其酶活性顯著降低。但是細胞質(zhì)中的二氫嘧啶脫氫酶的酶活性在低表達mitoN

9、EET之后并沒有顯著性變化。
　　3.高表達mitoNEET對線粒體內(nèi)外鐵硫簇水平的影響。
　　通過在MCF-7細胞中瞬時轉(zhuǎn)染高表達mitoNEET的野生型質(zhì)粒載體從而構(gòu)建高表達mitoNEET細胞模型，其mitoNEET mRNA和蛋白表達相對于對照細胞顯著性的增加。高表達mitoNEET對細胞線粒體內(nèi)外aconitase1、2的酶活性和蛋白表達水平均沒有明顯影響。
　　4.Rescue對mitoNEET細胞鐵硫簇轉(zhuǎn)

10、運功能的影響。
　　在穩(wěn)定低表達mitoNEET細胞株中瞬時轉(zhuǎn)染高表達mitoNEET野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒(H87S、H87C)均使細胞內(nèi)mitoNEET mRNA和蛋白表達顯著性的增加。轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的細胞可以恢復aconitase1的酶活性同時不影響其蛋白表達;轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的細胞(H87C和H87S)雖然能使細胞中mitoNEET的mRNA和蛋白表達水平恢復，但是不能使之前低表達mitoNEET導致降低的aconitase

11、1酶活性恢復，同時此過程中aconitase1的蛋白表達也沒有明顯變化。
　　結(jié)論:
　　本實驗成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達mitoNEET和其對照細胞株。MitoNEET會抑制細胞增殖速率。低表達mitoNEET不影響細胞質(zhì)中aconitase1蛋白水平而降低其酶活性，對其他線粒體內(nèi)外鐵硫蛋白活性無明顯影響。結(jié)果表明mitoNEET參與傳遞細胞鐵硫簇給細胞質(zhì)中的aconitase1。
　　高表達mitoNEET不影響線粒體內(nèi)

12、外鐵硫簇水平，aconitase1、2的蛋白表達和酶活性均沒有顯著變化。表明細胞中正常表達的mitoNEET已能夠發(fā)揮其鐵硫簇傳遞功能，過表達對其細胞鐵硫簇傳遞功能沒有影響。
　　在低表達mitoNEET細胞株中轉(zhuǎn)染野生型mitoNEET表達質(zhì)粒的細胞可以恢復其細胞質(zhì)的aconitase1的酶活性同時不影響該蛋白表達。轉(zhuǎn)染mitoNEET突變型(H87C和H87S)表達質(zhì)粒的細胞雖然能使細胞中mitoNEET mRNA和蛋白表達水