2014年廣州登革熱的分子流行病學(xué)與中藥對其患者炎癥因子的調(diào)節(jié).pdf

1、目的:
　　登革熱是世界范圍內(nèi)流行的疾病，其特點(diǎn)是發(fā)病率高，病情嚴(yán)重，波及范圍廣。感染登革熱病毒后，可根據(jù)發(fā)病的嚴(yán)重程度分為登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)三類，前者屬于輕癥，后兩者病情較重、致死率較高。登革熱病毒感染的范圍廣，危害大等特點(diǎn)使其成為全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題。近年來，廣州市不斷出現(xiàn)登革熱流行，進(jìn)入21世紀(jì)以來暴發(fā)了四次較大規(guī)模的登革熱流行，2014年疫情尤為嚴(yán)重，感染病例數(shù)接近4萬，并

2、有5例死亡，廣州已成為全國登革熱的重點(diǎn)防控區(qū)域，人們越來越關(guān)注廣州地區(qū)登革熱病毒的傳播來源以及登革熱病毒在全球的傳播情況。另外，在登革熱的治療方面目前仍然沒有十分有效的方法，由于西醫(yī)治療手段、疫苗和抗病毒藥物的缺乏，登革熱病毒感染后出現(xiàn)的危害難以得到根除。而近年來中醫(yī)藥在治療登革熱中取得了一定進(jìn)展，其獨(dú)特的治療理論發(fā)揮了明顯的治療優(yōu)勢，人們對中醫(yī)藥治療登革熱給予的希望越來越高，辛涼解表化濕方是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)劉小虹教授前期進(jìn)行抗病毒藥物

3、研究，篩選出抗病毒療效確切的中藥結(jié)合藥性藥味和嶺南地區(qū)的氣候特點(diǎn)組合而成的中藥復(fù)方，尚未考察其對登革熱的治療效果。
　　本課題研究目的在于探討2014年廣州地區(qū)登革熱傳播來源，并結(jié)合前期已公布的研究調(diào)查結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)生地理學(xué)知識，尋找2014年廣州地區(qū)登革熱病毒株的祖先位置，并模擬此病毒株隨時(shí)間變化在全球傳播的概況。另外，本課題還將從炎癥因子調(diào)節(jié)的角度探討辛涼解表化濕方對登革熱的治療效果。并希望通過以上研究，為我國后期登革熱的防控策

4、略與治療提供依據(jù)，進(jìn)而提高疫情防控效率、節(jié)省社會資源、保護(hù)人群健康。
　　方法:
　　1.在2014年廣州登革熱大流行期間于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)醫(yī)院收集登革熱病人血清樣本，收集的樣本進(jìn)行IgM和IgG抗體檢測，檢測結(jié)果為陽性的血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.將陽性患者血清接種到長滿單層的C6/36白紋伊蚊傳代細(xì)胞，吸附1小時(shí)后棄去，培養(yǎng)5天后收集培養(yǎng)液上清，提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-P

5、CR和real-time SYBR green RT-PCR的方法進(jìn)行病毒的鑒定與分型。
　　3.參考DENV-1 Hawaii株的基因序列，結(jié)合PremierPrimer5.0軟件設(shè)計(jì)合成DENV-1型登革熱病毒的E基因引物，并進(jìn)行PCR，跑膠，回收，測序。測序結(jié)果與GenBank中的病毒株進(jìn)行對比，用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析2014年登革熱病毒株的可能傳播來源。
　　4.結(jié)合貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生地理學(xué)方法，追溯2014年

6、廣州地區(qū)登革熱的傳播源頭，遷移過程，分析其種群多樣性。
　　5.從炎癥因子調(diào)節(jié)角度評價(jià)辛涼解表化濕方對登革熱的治療效果。
　　結(jié)果:
　　1.在廣州登革熱大流行期間，收集年齡為18-75歲之間，72小時(shí)內(nèi)體溫高于37.5℃患者的血清，并用ELISA試劑盒檢測IgM和IgG抗體，二者顯示陽性的血清確定為登革熱病毒感染，期間共收集168例陽性血清。男性70例，女性98例數(shù)，男性占總數(shù)的41.7％，女性占58.3％;發(fā)病年齡

7、在10歲以下的僅有1例，占病例總數(shù)的0.8％，10-20歲之間的5例，占總數(shù)4％，20-70歲為高發(fā)病年齡段，分別占病例總數(shù)的19.2％、12％、16.8％、28％、12％，70歲以上占7.2％;白云區(qū)、荔灣區(qū)、越秀區(qū)、海珠區(qū)患者居多，分別占患者總數(shù)的35.6％、23.7％、16.9％、11.0％，南沙區(qū)和花都區(qū)病例數(shù)為0。
　　2.鑒定與分型結(jié)果顯示:共17株登革熱病毒可見電泳條帶，條帶大小在350bp左右，相對應(yīng)的Tm值為82

8、.5℃。
　　3.對17例陽性樣本和各血清型登革熱病毒的E基因構(gòu)建基因進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示基因Ⅰ型8株，基因Ⅴ型9株，無基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。基因Ⅰ型的傳播來源分為兩支，其中6株病毒(KT037100、KT037101、KT037103、KT037105、KT037106、KT037109)與2006年、2009年、2013年、2015年廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)的病毒株聚類在一起，同時(shí)與2007年、2008年、2009年泰國病毒株和201

9、3年新加坡病毒株聚類在同一分支?；颌裥偷牧?株病毒（KT037107與KT037108）與2004年、2005年、2007年、2009年廣州病毒株，2005年、2008年、2012年、2013年、2014年的馬來西亞病毒株和2004年、2005年、2006年、2008年、2009年、2014年新加坡病毒株以及2007年、2008年、2010年、2011年、2012年、2013年印度尼西亞病毒株，2014年臺灣病毒株聚類在一起。基因Ⅴ型

10、的9株病毒(KT037099、KT037102、KT037104、KT037110、KT037111、KT037112、KT037113、KT037114、KT037115)與2009年、2010年、2011年、2013年廣東病毒株，2008年、2009年、2011年、2012年、2014年新加坡病毒株和2013年馬來西亞，2005年、2008年、2009年、2010年、2011年印度和2013年不丹病毒株聚類在一起。
　　4.基

11、因Ⅰ型MCC樹顯示的祖先節(jié)點(diǎn)位于泰國，后驗(yàn)概率為0.8579，地理擴(kuò)散時(shí)空圖和顯著路線圖顯示病毒擴(kuò)散的主要區(qū)域?yàn)闁|南亞地區(qū)，群體動力學(xué)結(jié)果顯示2007年種群多樣性最高，其后緩慢下降;基因Ⅴ型MCC樹顯示的祖先節(jié)點(diǎn)位于印度，后驗(yàn)概率為0.7429，地理擴(kuò)散時(shí)空圖和顯著路線圖顯示病毒擴(kuò)散的主要區(qū)域?yàn)閬喼藓兔乐薜貐^(qū)，種群多樣性在1970-1975迅速上升，其后多樣性居高不下。
　　5.患者治療前血液中IL-1、IL-6、IL-10、IL

12、-17、TNF-α、IFN-γ含量明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，與治療前比較，治療后血液中IL-1、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）;患者治療前血液中IL-1β含量無明顯變化（P＞0.05），但有升高的趨勢，與治療前比較，治療后血液中IL-1β含量無明顯變化(P＞0.05)，但有降低的趨勢;
　　結(jié)論:
　　1.對168例患者性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)女性患

13、者多余男性;兒童發(fā)病率最低，成年人發(fā)病率較高;白云區(qū)、荔灣區(qū)、越秀區(qū)、海珠區(qū)等老城區(qū)患者居多，其它區(qū)病例數(shù)較低，南沙區(qū)和花都區(qū)未統(tǒng)計(jì)到病例，可能受醫(yī)院所在地理區(qū)域的影響。
　　2.對擴(kuò)增的168例登革熱臨床樣本進(jìn)行鑒定與分型，鑒定與分型結(jié)果顯示，共分離得到17株病毒，17株登革熱病毒均屬于血清1型登革熱病毒。
　　3.結(jié)合大樣本量構(gòu)建的基因進(jìn)化樹分析基因Ⅰ型與基因Ⅴ型的傳播來源可知，基因Ⅰ型的傳播來源分為兩支，其中6株病毒極

14、有可能在2009年或更早由泰國傳入，并在廣州形成垂直傳播，在2013、2014年大流行的過程中廣泛的流行，并持續(xù)傳播到2015年。另外2株病毒的祖先一直在馬來半島地區(qū)或印度尼西亞流行，而廣州2014年病毒株最可能由馬來西亞傳入，此株病毒在2004年、2005年、2007年、2009年、2014年多次傳入廣州，2014年臺灣病毒株也由該地區(qū)傳入。基因Ⅴ型的9株病毒的祖先一直在馬來半島和印度地區(qū)傳播，而廣州2014年病毒株最可能由新加坡傳入