H2O2致人黑素細(xì)胞線粒體氧化損傷機(jī)制及補(bǔ)肝益腎中藥的保護(hù)作用.pdf

1、第一部分補(bǔ)肝益腎中藥對人黑素細(xì)胞黑素合成及遷移的影響
　　目的:對文獻(xiàn)報道的白癜風(fēng)中醫(yī)治療肝腎不足證中高頻使用的3味中藥（制何首烏、墨旱蓮、熟地黃）進(jìn)行體外實(shí)驗，檢測其水提物對人黑素細(xì)胞活力、酪氨酸酶活性、黑素合成及細(xì)胞遷移的影響，對3味中藥治療白癜風(fēng)的機(jī)理進(jìn)行了初步探討。
　　方法:(1)采用健康青年包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織進(jìn)行體外細(xì)胞原代培養(yǎng)，獲得人表皮黑素細(xì)胞。(2)采用MTT法檢測3味中藥不同濃度的水提物對黑素細(xì)胞活性

2、的影響，多巴氧化法檢測對細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響及氫氧化鈉裂解法檢測對黑素含量的影響。同時采用Transwell小室法檢測3種中藥水提物對黑素細(xì)胞遷移的影響及western blot法測定對MITF蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:(1)25、50、100、200ug/mL制何首烏對人黑素細(xì)胞活力的影響與空白對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，400ug/mL組可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖(P＜0.05);25、50、100、200、400u

3、g/mL墨旱蓮組均對人黑素細(xì)胞活力的無影響(P＞0.05);25、50、100、200ug/mL熟地黃組對人黑素細(xì)胞活力無影響(P＞0.05)，400ug/mL組可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖(P＜0.05)。(2)各濃度制何首烏組及熟地黃組對人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響雖呈上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);50、100、200、400ug/mL墨旱蓮組可顯著提高黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性(P＜0.05)。(3)各濃度制何首烏組對人黑素細(xì)胞黑素含

4、量的影響雖呈上升趨勢，但與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);50、100、200、400ug/mL墨旱蓮組及熟地黃組可顯著提高黑素細(xì)胞的黑素含量(P＜0.05)。(4)100ug/mL制何首烏組及墨旱蓮組穿過聚碳酯膜的黑素細(xì)胞數(shù)目分別為對照組的263％、172％，差異有顯著性(P＜0.05);熟地黃組穿過的細(xì)胞數(shù)目較少，與對照組相比差異無顯著性(P＞0.05)。(5)100ug/mL制何首烏組、墨旱蓮組、熟地黃組MITF蛋白的表

5、達(dá)量分別為對照組的140％、145％、143％，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)制何首烏水提物可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、遷移及MITF的表達(dá)，但是對酪氨酸酶活性及黑素合成無影響;熟地黃水提物可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成及MITF的表達(dá)，但對酪氨酸酶活性、細(xì)胞遷移無影響。(2)墨旱蓮水提物對黑素細(xì)胞生長無影響，但可以促進(jìn)酪氨酸酶活性、黑素合成、細(xì)胞遷移及MITF的表達(dá)，提示其機(jī)理可能是通過促進(jìn)黑素細(xì)胞移行及黑素合成2個環(huán)

6、節(jié)發(fā)揮治療作用，值得進(jìn)一步研究。
　　第二部分 H2O2所致人黑素細(xì)胞線粒體功能障礙對細(xì)胞遷移的影響及墨旱蓮的干預(yù)作用
　　目的:建立正常人黑素細(xì)胞氧化損傷模型;通過檢測H2O2所致氧化應(yīng)激狀態(tài)對人黑素細(xì)胞遷移、細(xì)胞骨架、線粒體超微結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位、ATP含量的影響及墨旱蓮的干預(yù)作用，探討H2O2所致線粒體功能障礙對人黑素細(xì)胞遷移的影響及墨旱蓮的保護(hù)作用。
　　方法:(1)采用MTT法檢測不同濃度、不同時間點(diǎn)H2O2

7、對黑素細(xì)胞活性的影響。(2)設(shè)立正常對照組、H2O2處理組、(50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL)墨旱蓮+H2O2處理組，采用Transwell小室法觀察不同處理因素對黑素細(xì)胞遷移的影響;羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光染色后共聚焦顯微鏡下觀察不同處理因素對細(xì)胞骨架F-actin的影響;透射電鏡下觀察不同處理因素對細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響;熒光探針JC-1檢測各處理因素對人黑素細(xì)胞膜電位的影響;熒光素酶法檢測各處理因素對人黑素細(xì)

8、胞內(nèi)ATP含量的影響。
　　結(jié)果:(1)建立了H2O2誘導(dǎo)體外黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的模型。(2)與空白對照組比較，H2O2處理組能明顯抑制黑素細(xì)胞的遷移(P＜0.05);與H2O2處理組比較，50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL墨旱蓮預(yù)處理各組細(xì)胞遷移率均有明顯提高(P＜0.05)。(3)與空白對照組比較，H2O2處理組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)纖維型肌動蛋白變得模糊不清、消失，且樹突明顯縮短。不同濃度墨旱蓮預(yù)處理后各組黑素細(xì)胞質(zhì)內(nèi)纖維型

9、肌動蛋白排列紊亂，但仍然可見，200ug/mL組細(xì)胞樹突明顯增多。(4)電鏡下H2O2處理組細(xì)胞內(nèi)線粒體基質(zhì)電子密度降低，嵴模糊不清甚至消失，可見空泡形成;不同濃度墨旱蓮預(yù)處理后各組黑素細(xì)胞線粒體輕度腫脹，線粒體內(nèi)的嵴擴(kuò)張，但仍可見到部分結(jié)構(gòu)清晰的線粒體。(5)與空白對照組比較，H2O2處理組能明顯降低黑素細(xì)胞線粒體膜電位(P＜0.05);與H2O2處理組比較，不同濃度墨旱蓮預(yù)處理后各組細(xì)胞線粒體膜電位均有明顯提高(P＜0.05)。(6

10、)與空白對照組比較，H2O2處理組能明顯降低黑素細(xì)胞內(nèi)ATP的含量(P＜0.05);與H2O2處理組比較，不同濃度墨旱蓮預(yù)處理后各組細(xì)胞內(nèi)ATP含量均有明顯提高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)0.1mM H2O2處理30min的條件下可誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。(2)H2O2所致的氧化應(yīng)激狀態(tài)可能是通過影響黑素細(xì)胞線粒體功能，降低了ATP生成，破壞了細(xì)胞骨架，從而抑制了細(xì)胞的遷移。(3)墨旱蓮提取物則可能是通過保護(hù)了線粒

11、體功能而達(dá)到改善H2O2造成黑素細(xì)胞遷移障礙的作用。
　　第三部分墨旱蓮對H2O2所致人黑素細(xì)胞線粒體功能氧化損傷相關(guān)信號分子的影響
　　目的:探討H2O2所致人黑素細(xì)胞線粒體功能氧化損傷的相關(guān)分子機(jī)制及墨旱蓮的保護(hù)作用。
　　方法:(1)采用原代培養(yǎng)三個不同人來源的黑素細(xì)胞，分別設(shè)立正常對照組、H2O2處理組，通過6張表達(dá)譜芯片篩選H2O2作用下差異表達(dá)的與線粒體功能障礙相關(guān)信號分子，并采用實(shí)時熒光定量RT-PCR驗

12、證差異表達(dá)的基因。(2)設(shè)立正常對照組、H2O2處理組、(50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL)墨旱蓮+H2O2處理組，采用實(shí)時熒光定量RT-PCR及western blot法從mRNA和蛋白水平對篩選出的基因進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:(1)以Fold change≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的mRNA分子，結(jié)果顯示共有1880個差異表達(dá)基因，其中763個基因表達(dá)上調(diào)、1117個基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步通過GO分析和Pathway

13、分析，從中挑選出與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的差異表達(dá)基因11個，經(jīng)驗證顯示和未予H2O2處理的對照組相比，H2O2處理組ND2、COX1和COX3基因的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。(2)不同濃度墨旱蓮提取物預(yù)處理組與H2O2組比較，均能明顯上調(diào)基因ND2、COX1及COX3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)表達(dá)譜芯片篩選并驗證后提示H2O2明顯抑制線粒體氧化磷酸化過程中ND2、COX1及COX3基因的表達(dá)，提