線粒體轉(zhuǎn)錄因子A對(duì)肝外膽汁淤積肝細(xì)胞mtDNA氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　 肝外膽汁淤積常由于一些惡性腫瘤、肝外膽管結(jié)石阻塞膽管或先天膽道閉鎖導(dǎo)致膽汁流出受阻，膽汁積聚肝內(nèi)，疏水性的膽汁酸引起肝細(xì)胞凋亡和壞死，最后可導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化。對(duì)一些膽管阻塞時(shí)間長(zhǎng)，黃疸程度深的患者，不僅手術(shù)耐受能力低，即使膽道梗阻解除了，術(shù)后肝功能仍然恢復(fù)慢，甚至出現(xiàn)肝功能進(jìn)一步損害，造成臨床治療失敗。
　　 因此，膽汁淤積如何引起肝臟功能損害，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。氧化應(yīng)激和線粒體功

2、能障礙涉及到慢性肝臟膽汁淤積的發(fā)病機(jī)制，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，極易發(fā)生氧化損傷。一旦mtDNA損傷超過(guò)某個(gè)閾值，mtDNA通過(guò)其編碼的呼吸鏈亞基對(duì)氧化應(yīng)激具有放大作用，這樣會(huì)加重線粒體的氧化損傷直至細(xì)胞死亡。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)具有結(jié)合和纏繞mtDNA及解螺旋能力，對(duì)維持mtDNA空間構(gòu)想，調(diào)節(jié)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及損傷修復(fù)具有重要作用?；谝陨涎芯勘尘?，本課題擬研究

3、肝外膽汁淤積患者肝損傷與肝mtDNA改變的關(guān)系，探討線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在肝外膽汁淤積中的表達(dá)及其對(duì)肝細(xì)胞mtDNA的保護(hù)作用，從而達(dá)到保護(hù)和改善膽汁淤積患者肝功能的目的。
　　 二、材料與方法
　　 1.病例標(biāo)本與細(xì)胞系：嚴(yán)格按照入組條件選擇12個(gè)梗阻性黃疸患者，其中胰腺癌6例，壺腹周圍癌4例，膽管癌2例。10個(gè)非梗阻性黃疸患者為對(duì)照組，其中胰腺癌4例，膽囊結(jié)石6例。兩組患者在年齡、性別上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有病例排除病毒性肝

4、炎感染、肝自身免疫性疾病或代謝性疾??；未用過(guò)有肝臟毒性的藥物；有酒精肝患者也被排除。術(shù)中肝組織標(biāo)本獲取過(guò)程一致，排除肝門阻斷對(duì)mtDNA的影響。切取的肝組織標(biāo)本迅速浸泡于液氮罐中，并保存在-80℃冰箱中。人正常肝細(xì)胞株L02購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。
　　 2.HE染色觀察病例標(biāo)本肝臟組織病理變化；試劑盒檢測(cè)氧化損傷指標(biāo)MDA、8-OHdG改變及線粒體功能指標(biāo)ATP含量的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mtDNA及mtDNA轉(zhuǎn)錄水平

5、mtRNA改變；免疫組織熒光檢測(cè)mtDNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG的變化及mtDNA核樣結(jié)構(gòu)(anti-DNA)的改變。
　　 3.甘氨酸鵝去氧膽酸(GCDCA)處理L02細(xì)胞模擬膽汁淤積體外模型，試劑盒檢測(cè)L02細(xì)胞線粒體氧化指標(biāo)ROS、8-OHdG改變、細(xì)胞活性和線粒體膜電位、ATP含量的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mtDNA及mtDNA轉(zhuǎn)錄水平mtRNA改變；免疫組織熒光檢測(cè)mtDNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG的變化及mtD

6、NA核樣結(jié)構(gòu)(PicoGreen)的改變。
　　 4.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western-blot檢測(cè)肝外膽汁淤積患者及GCDCA處理L02細(xì)胞后TFAM mRNA和蛋白水平的變化。
　　 5.利用重組質(zhì)粒pEGFP-N1-TFAM、pEGFP-N1-△ C-TFAM及pEGFP-N1對(duì)照，過(guò)表達(dá)TFAM或△C-TFAM后，觀察其對(duì)GCDCA處理L02細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄水平mtRNA的影響；觀察過(guò)表達(dá)TFAM

7、或△C-TFAM后對(duì)肝細(xì)胞線粒體功能的改變；免疫組織熒光檢測(cè)mtDNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG的變化及mtDNA核樣結(jié)構(gòu)(PicoGreen)的改變。
　　 三、結(jié)果
　　 1.肝外膽汁淤積患者HE：肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)膽色素沉積，肝細(xì)胞輪廓不清，腫脹，變性壞死，可見(jiàn)空泡樣變；肝血竇擴(kuò)張，膽小管擴(kuò)張，內(nèi)見(jiàn)膽汁淤積，
　　 小葉內(nèi)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組相比，肝外膽汁淤積患者M(jìn)DA升高4倍，ATP生成減少

8、37％，肝組織線粒體內(nèi)8-OHdG定量檢測(cè)升高9.9倍(p<0.01)。免疫熒光檢測(cè)膽汁淤積患者肝細(xì)胞mtDNA均發(fā)現(xiàn)有明顯的氧化損傷，而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)有氧化損傷。實(shí)時(shí)定量PCR顯示膽汁淤積患者肝組織mtDNA拷貝數(shù)較對(duì)照組下降了60％(p<0.01)，代表mtDNA編碼基因轉(zhuǎn)錄水平COX1，ND1和ND6均有明顯下降(p<0.05)，免疫熒光檢測(cè)肝外膽汁淤積患者mtDNA核樣結(jié)構(gòu)明顯減少。
　　 2.GCDCA處理L02細(xì)胞后，

9、隨著GCDCA濃度增加，L02細(xì)胞線粒體氧化指標(biāo)ROS含量、8-OHdG水平逐漸增加；肝細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄水平mtRNA逐漸減少；線粒體功能(CCK-8、膜電位、ATP含量)下降。免疫細(xì)胞熒光顯示隨著GCDCA濃度增加肝細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量逐漸增加而mtDNA核樣結(jié)構(gòu)逐漸減少。
　　 3.實(shí)時(shí)定量熒光PCR顯示肝外膽汁淤積患者TFAM mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，在GCDCA(50，75，100μ M)處理L02細(xì)胞

10、6小時(shí)后TFAM mRNA表達(dá)較對(duì)照組分別下降了27％，32％和60％(p<0.05)；Western-blot結(jié)果顯示，肝外膽汁淤積患者TFAM蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少；與對(duì)照組相比，GCDCA250M處理L02細(xì)胞6小時(shí)后，TFAM蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但隨著GCDCA濃度加大(50，75，100μM)，TFAM蛋白表達(dá)逐漸減少，100μ M時(shí)達(dá)最低。
　　 4.過(guò)表達(dá)TFAM后，GCDCA處理的L02細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)增加

11、及轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)，肝細(xì)胞活力和線粒體功能(膜電位、ATP含量)得到改善。免疫細(xì)胞熒光顯示肝細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量逐漸下降而mtDNA核樣結(jié)構(gòu)逐漸增加。而過(guò)表達(dá)△C-TFAM，由于敲除了TFAM蛋白中具有轉(zhuǎn)錄活性的C末端，僅保留其維持mtDNA核樣結(jié)構(gòu)和維持拷貝數(shù)的功能，故其對(duì)肝細(xì)胞線粒體功能的改善程度較野生型差。
　　 四、結(jié)論
　　 1.肝mtDNA氧化損傷參與了肝外膽汁淤積患者肝細(xì)胞功能損害。
　　 2.肝mt