重組蛇毒纖溶因子rFⅡ特異性相關序列研究.pdf

1、[目的]探討重組蛇毒纖溶因子(rFⅡ)作用特異性的分子機制。 [方法]通過與出血毒素比對，找到非出血的rFⅡ的C末端的同源差異序列作為研究其作用特異性的靶點。(一)首先考查了該序列在整體結構中的作用，用SOEingPCR構建了刪除該區(qū)域的突變體。突變體和rFⅡ都在畢赤酵母中表達，用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所表達的蛋白，表達上清分別過陰離子和疏水層析柱純化。蛋白純化后，采用下列方法對其生化特性進行分析：①對不同

2、濃度顯色底物(D-Pro-Phe-Arg-pNA、N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA和N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA)的動力學變化測定；②裂解氧化胰島素B鏈，觀察突變后酶作用的特異性；③對纖維蛋白(原)裂解活性的比較；④熱處理觀察其活性隨溫度升高的變化趨勢，考察其熱敏感性；⑤圓二色譜測定預測其二級結構的改變。(二)另外，根據(jù)rFⅡ的一個同源蛋白展示出與rFⅡ作用特異性不同的現(xiàn)象，構建互換其C端的同

3、源差異序列的突變體，轉化酵母細胞，并用同源建模的方法分析了互換同源差異序列后其空間構象的變化。 [結果](一)對刪除序列的突變體來說，酵母分泌的蛋白通過SDS-PAGE和Westernblot得到確認后，其純化的蛋白與rFⅡ相比，其生化特性的改變?yōu)椋孩賠FⅡ及突變體對顯色底物D-Pro-Phe-Arg-pNA及N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA無裂解活性，而對N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA

4、，突變體的催化效率是rFⅡ的1.9倍；②rFⅡ及突變體對氧化胰島素B鏈的裂解早期都發(fā)生在12-13位點，但隨后的裂解模式有所不同；③突變體對纖維蛋白及纖維蛋白原的水解能力有所增強；④熱處理表明突變體相對rFⅡ，對于溫度的升高更敏感；⑤圓二色譜測定表明突變后起支撐作用的二級結構變化不明顯。(二)對交換區(qū)域的突變體來說，成功生成了工程菌，在表達和純化前先用同源建模的方法對突變后的構象進行了分析：發(fā)現(xiàn)了與特異性密切相關的構象變化以及在這一重新