重組蛇毒纖溶因子rFⅡ特異性相關(guān)序列研究.pdf

1、[目的]探討重組蛇毒纖溶因子(rFⅡ)作用特異性的分子機(jī)制。 [方法]通過(guò)與出血毒素比對(duì)，找到非出血的rFⅡ的C末端的同源差異序列作為研究其作用特異性的靶點(diǎn)。(一)首先考查了該序列在整體結(jié)構(gòu)中的作用，用SOEingPCR構(gòu)建了刪除該區(qū)域的突變體。突變體和rFⅡ都在畢赤酵母中表達(dá)，用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所表達(dá)的蛋白，表達(dá)上清分別過(guò)陰離子和疏水層析柱純化。蛋白純化后，采用下列方法對(duì)其生化特性進(jìn)行分析：①對(duì)不同

2、濃度顯色底物(D-Pro-Phe-Arg-pNA、N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA和N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA)的動(dòng)力學(xué)變化測(cè)定；②裂解氧化胰島素B鏈，觀察突變后酶作用的特異性；③對(duì)纖維蛋白(原)裂解活性的比較；④熱處理觀察其活性隨溫度升高的變化趨勢(shì)，考察其熱敏感性；⑤圓二色譜測(cè)定預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。(二)另外，根據(jù)rFⅡ的一個(gè)同源蛋白展示出與rFⅡ作用特異性不同的現(xiàn)象，構(gòu)建互換其C端的同

3、源差異序列的突變體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并用同源建模的方法分析了互換同源差異序列后其空間構(gòu)象的變化。 [結(jié)果](一)對(duì)刪除序列的突變體來(lái)說(shuō)，酵母分泌的蛋白通過(guò)SDS-PAGE和Westernblot得到確認(rèn)后，其純化的蛋白與rFⅡ相比，其生化特性的改變?yōu)椋孩賠FⅡ及突變體對(duì)顯色底物D-Pro-Phe-Arg-pNA及N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA無(wú)裂解活性，而對(duì)N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA

4、，突變體的催化效率是rFⅡ的1.9倍；②rFⅡ及突變體對(duì)氧化胰島素B鏈的裂解早期都發(fā)生在12-13位點(diǎn)，但隨后的裂解模式有所不同；③突變體對(duì)纖維蛋白及纖維蛋白原的水解能力有所增強(qiáng)；④熱處理表明突變體相對(duì)rFⅡ，對(duì)于溫度的升高更敏感；⑤圓二色譜測(cè)定表明突變后起支撐作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯。(二)對(duì)交換區(qū)域的突變體來(lái)說(shuō)，成功生成了工程菌，在表達(dá)和純化前先用同源建模的方法對(duì)突變后的構(gòu)象進(jìn)行了分析：發(fā)現(xiàn)了與特異性密切相關(guān)的構(gòu)象變化以及在這一重新