靶向人fgl2的腺病毒微小RNA在肝癌的體內(nèi)、外干預研究.pdf

1、目的：
　　纖維蛋白原樣蛋白2(Fibrinogen-like protein2/fibroleukin)又稱纖維介素，有膜型和分泌型兩種形式，mfgl2(membrane fgl2)主要表達在腫瘤細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等表面,可催化凝血酶原為凝血酶，從而參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等病理過程中。本實驗室成功合成靶向人fgl2的腺病毒微小RNA（Ad-hfgl2-miRNA），本研究旨在探討其對人腫瘤細胞增殖的影響，進一步進行肝癌裸鼠皮下

2、荷瘤的體內(nèi)干預研究。
　　方法：
　　1.流式檢測人正常肝細胞LO2、肝癌細胞LM3、宮頸癌細胞Hela、鼻咽癌細胞CNE和大細胞肺癌細胞NCIH460表面hfgl2和柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor CAR）表達；
　　2.采用Western-Blot檢測Ad-hfgl2-miRNA對fgl2蛋白干預作用；
　　3.確定Ad-hfgl2-miRNA感染人腫瘤

3、細胞的最適感染復數(shù)（multiplicity of infection, MOI）；
　　4. CCK-8法檢測Ad-hfgl2-miRNA對LM3、Hela、CNE和NCIH460細胞增殖的影響；
　　5.將人肝癌細胞LM3接種于裸小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型，將瘤體積達到約100mm3的荷瘤鼠隨機分組，分別行瘤內(nèi)注射高、中、低劑量（3.3*1010IU、1.0*1010IU、3.3*109IU）Ad-hfgl2-miRN

4、A及非相關對照腺病毒，6天干預1次，共干預3次，干預期間測量瘤體大小，計算腫瘤體積、相對腫瘤體積及相對腫瘤增殖率。
　　結果：
　　1.流式檢測hfgl2在人正常肝細胞LO2幾乎不表達，在人腫瘤細胞LM3、Hela、CNE和NCIH460細胞表面均有表達，靜息狀態(tài)下表達fgl2的Hela細胞陽性率為12％，不同濃度TNF-α刺激下其fgl2表達水平不同，在40ng/ml濃度下表達水平最高，可達到25%；靜息狀態(tài)下表達fgl2

5、的LM3、CNE、NCIH460細胞陽性率分別為15%、19.1%、15.9%。
　　2.WB結果表明Ad-hfgl2-miRNA對目的蛋白fgl2表達有抑制效應。
　　3.Ad-hfgl2-miRNA感染LM3、Hela、CNE和NCIH460細胞最適MOI值分別是200、50、100、100。
　　4.CCK-8法表明不同濃度Ad-hfgl2-miRNA對LM3、Hela、CNE和NCIH460細胞均有增殖抑制作用

6、，并表現(xiàn)出劑量依賴性，和陰性對照相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　5.建立人肝癌LM3裸小鼠移植瘤模型，干預第10天時，高、中、低劑量（3.3*1010IU、1.0*1010IU、3.3*109IU）干預組平均腫瘤體積均小于非相關對照組，分別為523.0±44.19 mm3 VS1042±138.8 mm3，P<0.05；546.5±22.41 mm3 VS1042±138.8 mm3，P<0.05;622.4±82.93 mm3

7、VS1042±138.8 mm3，P<0.05），此后每個測量時間點，各個干預組的平均腫瘤體積均小于對照組，至治療第19天，腫瘤體積分別為307.2±22.30 mm3 VS2351±593.7 mm3，P<0.01；704.4±60.18 mm3 VS2351±593.7 mm3，P<0.01；1042±50.07mm3 VS2351±593.7mm3，P<0.05；在治療第10天、13天、16天、19天時四個時間點，高、中劑量（3.

8、3*1010IU、1.0*1010IU）干預組的相對腫瘤體積均顯著小于對照組，低劑量干預組（3.3*109IU）和對照組無顯著差異。在治療第16天，高、中、低劑量組的相對腫瘤抑制率分別為24.5%、54.7%、101.1%，第19天時相應各組相對腫瘤抑制率分別為15%、32.7%、64.5%，其中從第16天開始，高劑量（3.3*1010IU）干預組的相對腫瘤抑制率均小于40%，干預效果顯著。結果顯示Ad-hfgl2-miRNA對HCCL